Westernblotting蛋白免疫印迹实验资料.pptxVIP

蛋白免疫印迹（WesternBlot）生物实验培训系列之三目录2目录31.WB的概念2.WB的应用3.WB的原理4.WB的特点1.1蛋白免疫印迹的概念是将电泳分离后的总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。41.2蛋白免疫印迹的应用基因在蛋白水平的表达研究例：吴德平,王颖等.立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原的免疫印迹分析[J].中国人兽共患病学报,2009,25(10):931-934.抗体活性检测例：胡纪文，马东礼.免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体的应用价值[J].热带医学杂志,2013,13(8):952-956.疾病早期诊断例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期诊断中的应用[J].中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29.51.2蛋白免疫印迹的应用检测样品中特异性蛋白质是否存在例：李桂波.利用免疫印迹法钓取PC3M细胞中与人前列腺癌高转移相关特异性短肽结合蛋白的研究[D].吉林:吉林大学,2007.对特异性蛋白质进行半定量分析例：61.3WB的原理WB采用的是聚丙烯酰氨凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质进行着色。通过分析着色的位置和着色的深度获得特定的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。71.4WB的特点WB是在蛋白质电泳分离和抗原、抗体检测基础上发展起来的检测蛋白质的技术SDS凝胶电泳：高分辨率抗原抗体反应：特异性转膜：灵敏度8目录91.试剂2.耗材3.设备2.1试剂甲叉双丙烯酰胺TrisHCLSDS10丙烯酰胺过硫酸铵TEMED2.1试剂11RIPA裂解液SDSloadingBuffer封闭液ECL显影液2.1试剂122.1试剂配置聚丙烯酰胺储存液：29g丙稀酰胺、1gN,N-亚甲叉双丙稀酰胺、加H2O至100mL。注意事项:应以温热的去离子水配制储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实pH不得超过7.0，因光催化或碱催化可以发生脱氨基反应。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。132.1试剂配置分离胶缓冲液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8)):18.15gTris和48mL1mol/LHCL混合加水稀释到100mL终体积。浓缩胶缓冲液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mLH2O中，用约48mL1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100mL终体积。注意事项:过滤后4℃保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节pH值，而不用Tris-HCL。转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至总量1L。142.1试剂配置SDS蛋白上样缓冲液:pH6.8的0.5mol/LTris缓冲液8mL，甘油6.4mL，10%SDS12.8mL，巯基乙醇3.2mL，0.05%溴酚蓝1.6mL，H2O32mL混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，沸水煮3min，混匀后再上样，一般为20-25μL，总蛋白量100μg。Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000mL，临用前稀释10倍。152.2耗材移液枪/枪头滤纸蓝盖玻璃瓶量筒容量瓶离心管烧杯96孔板PVDF膜海绵垫162.3设备垂直电泳仪化学发光成像系统台式离心机172.3设备高压灭菌锅电子天平电热恒温鼓风干燥箱182.3设备磁力搅拌器4℃、-20℃冰箱19目录201.实验步骤2.结果分析3.注意事项3.1实验步骤蛋白样品制备蛋白含量测定213.1.1蛋白样品制备在六孔板中，按照一个孔添加150μL的比例添加适量RIPA裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。样品放置冰上30min（中间混匀5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作22裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150μL裂解液，若细胞密度非常高可以适当加大裂解液用量至200μL或250μL。a).配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。b).将标准品、待测样品和工作液按下表加入到96孔板中，混匀。23管号试剂(μL)空白管标准管测定管×21×32×33x34×35×36×3蛋白质标准液(1mg/mL蒸馏水(μL待测样(μL)———