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第 1 次课 6 学时 上次课复习： 本次课题（或教材章节题目）： 实验四、质粒DNA提取（碱变性法） 教学要求： 熟悉质粒提取的过程，掌握质粒提取中各试剂的作用原理 重 点： 质粒在分子生物学中的作用，各试剂的作用原理 难 点： 质粒提取中各试剂的作用原理 教学手段及教具： 板书结合实际演示 讲授内容及时间分配： 一 质粒 1 质粒plasmid）： 5分钟 2 质粒与宿主细胞的关系5分钟 3 质粒提取实验在生物化学与分子生物学中具有非同寻常的意义 注：本页为每次课教案首页 实验四、质粒DNA提取（碱变性法） 一 质粒 1 质粒plasmid）：是染色体外小型（1-200kb）的共价、DNA分子（cccDNA， （1）质粒对宿主的生存不是必需的，只是“友好”的“借居”宿主细胞中，既不杀伤细胞，对宿主的代谢活动也无影响，宿主离开质粒照样的生存下去。 （2）质粒离开宿主就无法生存，只有依赖宿主细胞的（酶和蛋白质）帮助，才能完成自身的复制（扩增）、转录。 （3）质粒经常为宿主执行一些适当的遗传功能，作为对宿主细胞的补偿。 （4）质粒赋于宿主各种有利的表型，使宿主获得生存优势。 3 质粒提取实验在生物化学与分子生物学中具有非同寻常的意义转基因的时候不会转移直接的外源基因，需要把外源基因连接到载体上进行转化。载体的存在就像一个运输工具一样，把目的基因转到受体生物中。主要是利用染色体DNA和质粒DNA碱性环境中变性和复性的差异来分离出质粒DNA。染色体DNA 分子量比较大，在碱性环境中（高pH）变性，双链解拆开，抽提时由于机械剪切力的作用，环状断裂成线状，当pH 恢复中性时，无法恢复成环状，就呈网状与蛋白质一起通过离心沉淀下来。质粒DNA 分子量小，在碱性环境中（高pH），双链解旋，但不拆开,当pH恢复中性时，恢复成环状。由于分子量小，所以离心沉淀时，不下沉，保留在上清溶液中。PUC18质粒的单菌落于3ml Amp+LBg 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、5g NaCL于1L 烧瓶中，950mlddH2O，5MNaOH调pH到7.0，补充至ddH2O1L，高压灭菌。 Amp加入量是千分之一1mL Amp(100mg/mL)倒板。 LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入9g-15g琼脂粉 2 370C，10-200rpm振荡培养过夜6000rpm、离心2min，收集菌体100uL预冷的溶液I悬浮菌体（min 　溶液I： Tris-Cl (pH8.0) 25 mmol/L Glucose 50mmol/L EDTA 10mmol/L 溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。50mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA：乙二胺四乙酸,金属酶抑制剂，保护DNA。大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，抑制DNase的活性。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。200uL溶液II（5min裂解菌体 II： 终浓度 NaOH 0.2mol/L SDS 1% 溶液II是用新鲜的0.4 mol/L的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。150uL溶液III（5min 溶液III3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。这是十二烷基硫酸钠遇到钾离子后