细胞信号转导研究方法重点讲述.ppt

信号转导的研究方法 生物样品的处理 组织样品 采集：新鲜、未污染，剥去脂肪和筋皮等结缔组织 若保存，液氮速冻，-80℃冻存 蛋白质成分的保护 通常在生物样品中加入适量的蛋白酶抑制剂：PMSF（苯甲磺酰氟）、EDTA、胰蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂和亮抑蛋白酶肽。 低温保存：根据蛋白质的用途决定保存温度：4、-20还是-80，特殊要液氮 冻溶： -20或-80→4（一天） →室温 均匀摇晃，勿产生气泡，减少沉淀 组织提取物的制备：提取可溶蛋白（尽可能选择含目标蛋白高的组织） 步骤及注意事项： 1、切成小块，放入预冷匀浆器，加入预冷缓冲液（2倍体积） 2、匀浆1-3min，若较长时间，则间隔1min 3、匀浆方法选择：有的组织在匀浆前先冷冻后有利于破碎；人工匀浆 4、缓冲液的选择：使用中性PH、离子强度适当 5、抑制蛋白酶的加入：根据蛋白质的可能降解情况加入（酶抑制剂价格昂贵） 6、低温高速或超速离心 7、超声的方法 细胞破碎与分离 破碎方法： 机械法： 非机械法：溶胞作用：酶溶法、化学法、物理法 酶溶法：用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解 常用：溶菌酶、β-1,3葡聚糖酶、蛋白酶等； 缺点：价格高，通用性差 化学渗透法：化学药品改变细胞壁或膜的通透性 有机溶剂（苯、甲苯）、表面活性剂（SDS、TritonX-100）、金属螯合剂（EDTA