双向电泳样品缓冲液选用的基本原则.doc

双向电泳样品缓冲液选用的基本原则 蛋白质样品的特征： 复杂，含盐或其他污染物 易被蛋白酶降解 动态范围宽（106） 溶解性不均一（疏水性/亲水性） 分子量、等电点的范围宽(10-500KDa， pH2-14) 样品分离的基本要求： 高灵敏度和分辨率 宽动态范围 小样品体积 高通量 合适的温度和pH 避免蛋白酶降解 适合与高灵敏度的质谱联用 尽量少的操作步骤减少污染和损失 双向电泳和多维色谱法均符合以上要求，主要讨论双向电泳样品缓冲液的选用 样品缓冲液的组成： 3.1尿素：一种中性变性剂，破坏氨基酸残基之间的非共价键和离子键而不影响等电聚焦，浓度范围5-9.8mol/L，溶液不稳定，降解生成的氰酸根离子与蛋白质的氨基结合改变蛋白质的等电点。加精胺能降低影响。 3.2 硫尿：与尿素一起，能增加疏水膜蛋白的溶解性，缺点是在平衡液里与蛋白的半胱氨酸竞争结合碘代乙酰胺，会使蛋白的烷基化不完全，硫尿还有抑制SDS与蛋白质结合的作用，也可能增加脂类的溶解性，影响二向的效果。一般是2mol/L的硫尿与5-7mol/L尿素结合使用。 3.3 去污剂：蛋白质在去折叠后，会暴露出大量的疏水性残基，去污剂用于破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。阴离子去污剂SDS，不利于稳定等电聚焦中蛋白质的等电点，浓度不超过0.25%，NP-40:SDS=8：1，常用的有非离子型去污剂Triton X-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS， ASB-14,C8，SB3-10等。非离子型去污剂和两性离子去污剂能在不破坏蛋白质结构，保持生物活性的情况下改善蛋白质的溶解度，但是必须选择合适的浓度，浓度太低不能改善蛋白质的溶解性，浓度太高会使蛋白带变宽，影响分辨率和引起纹理现象。各种去污剂结合使用浓度范围0.5-4%. 3.4还原剂:还原剂能打开蛋白质的二硫键。一般使用β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE），DTT和DTE本身带有电荷，在等电聚焦时会迁移到pH范围以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对使溶解度降低而重新沉淀下来。一般的浓度范围10-100mmol/L,非离子型还原剂如三丁基膦(TBP)2mmol/L能增加蛋白质的溶解性，并可帮助蛋白质从第一向转移到第二向。不过TBP有剧毒，操作时应相当小心，并做好防护工作。 3.5 载体两性电解质：它有两个基本特性，一是两性的，能够在分离柱中达到一个平衡位置，二是可以作为“载体”，能够“运载”电流和pH能力。Biolyte是在丙烯乙胺与乙烯亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中再引入磺酸基团或磷酸基团后合成的。其他特性是分子量小，可溶性好，缓冲能力强，导电性均匀，紫外吸收低，不发荧光，无毒、无生物学效应，具有螯合性质。所有载体两性电解质分子都荷电，只是在溶液中荷正电和荷负电是相等的，所以总的净电荷为零，当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极和阳极移动，当它达到净电荷是零的位置时才停止从而给出一个pH梯度。也必须选用合适的浓度，一般使用的浓度范围是0.2-2%。 3.6 蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂能够暂时或者永久性的破坏蛋白酶的活性，减少蛋白质被降解和修饰的可能性。常用的蛋白酶及其作用位点和浓度范围见参考文献1的表2。 3.7 DNase I 和RNase A。消化DNA和RNA，减少污染。 注意事项： 见参考文献2，p20-21。 参考文献： (Proteomics 2003, 3, 1408–1417)Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis 《肿瘤蛋白质组学》，陈主初、梁宋平主编，湖南科学技术出版社 《蛋白质电泳实验技术》，郭尧君编著，科学出版社 2-D Electrophoresis using Immobilized pH gradients, principles and methods，安玛西亚公司操作手册 2-D Electrophoresis for ProteomicsA Methods and Product Manual. bio-rad公司操作手册 Proteomics in Practice。Dr. Reiner Westermeier, Dr. Tom Naven。 Wiley-VCH Verlag GmbH 细胞样品制备（分步）操作规程 仪器：电子天平、研钵、旋涡混和器、超声仪、高速离心机、分光光度计、低温冰箱、0.5ml离心管、1.5ml离心管 试剂： 细胞收集液：10mM Tris、250mM 山梨醇，pH7.0 可溶蛋白提取液：40mM Tris base(pH8.5) 微溶蛋白提取液（可根据样品不同而改变）：8 M 尿素、4% CHAPS、40mMTris base(pH8.5)