培训课件--噬菌体展示技术和其应用.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 靶蛋白孔 扩增，投入下一轮筛选 投入噬菌体抗体库 孵育 洗涤 洗脱 2 3 1 * * 可实现单抗的小型化 可实现单抗的多功能化 简单易行、生产成本低、筛选容量大、可通过发酵生产、大量制备 噬菌体抗体库技术的优势 * * 制备人源抗体 制备各级功能抗体片段 抗感染 抗肿瘤 噬菌体抗体库技术的应用 * * 处在临床研究阶段的抗肿瘤单抗 抗体 临床研究阶段 治疗肿瘤 公司 抗Her 2抗体 Ⅲ期临床研究 转移性乳腺癌 Genetech公司 抗VEGF嵌合性人源化抗体 Ⅱ期临床研究阶段 晚期实体瘤 Genetech公司 抗EGFR嵌合性抗体 Ｉ/Ⅱ期临床研究 头颈癌、肾癌、 前列腺癌和乳腺癌 Imclone公司 3622Ｗ94 人源化单抗 Ｉ/Ⅱ期临床研究 结肠、前列腺和 肺等上皮组织癌症 Glaxo Wellocme公司 * * 谢谢 * * * * * * * * * * * * * * * 最初以M13噬菌体为载体，宿主菌是大肠杆菌。 * * * * * * * * * * * * * * 结果 PCR扩增人抗体基因 图3.1 λ链PCR扩增结果 1-6泳道：VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6 M：Marker DL2,000 图3.2 κ链PCR扩增结果 11-3泳道：VK1, VK2, VK3 M：Marker DL2,000 * * 图3.3 重链分段PCR扩增结果 1－3泳道：H135，H2，H4(约290bp) 4－7泳道：CDR3-5, CDR3-8, CDR3-10, CDR3-12(约400bp) M：Marker DL2,000 * * 图3.4 重链重叠PCR扩增结果 1－3泳道： CDR3-5+(H135，H2，H4) 融合结果 4－6泳道： CDR3-8+(H135，H2，H4) 融合结果 7－9泳道： CDR3-10+(H135，H2，H4) 融合结果 10－12泳道：CDR3-12+(H135，H2，H4) 融合结果 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 M * * 图3.5轻链和重链插入pComb3 流程 H L * * 人源轻链抗体文库的构建 经限制性内切酶SacI和XbaI 双酶切的人抗体轻链PCR产物与用相同内切酶酶切、去磷酸化的pComb3载体，16℃连接，用该连接产物进行电转化，根据1μl和10μl菌液铺平板所长出来的菌落数，可推算出人抗体轻链文库的库容量。 κ链文库的容量为5.03×106,λ链文库的容量为6.8×106(多次建库混合后的库容量)。 从平板上随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养，菌落PCR鉴定。对于λ链文库，10个克隆中有6个阳性，λ链文库的插入率大约为60％；κ链文库10个克隆中有7个是阳性，其插入率大约为70％。 * * 人源噬菌体Fab抗体半合成文库的构建 将酶切纯化的重链重叠PCR产物插入经酶切、并切胶回收纯化的轻链抗体文库中，转化感受态细胞，在辅助噬菌体VCSM13的超感染下，繁殖出表达人抗体Fab段的噬菌体，即为抗体组合文库。1μl和10μl转化菌铺平板计数，计算出κ＋Fd（包括CDR3-5到CDR3-12的全部随机化Fd片段）文库的库容为5.89×106。随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR：其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率为60％左右。 * * 以相同的程序构建λ＋Fd链抗体库，库容量为6.55×106, 随机挑取10个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR：其中有5个克隆扩增出轻链和重链片段。双链插入率为50％左右。 为了提高抗体库的库容量，在增加细菌转化效率的同时，进行了多次转化，每次转化都计算插入率。结果如表所示。 * * 表3.1抗体库的库容与抗体片段插入率 ND ：未做 * * 混合抗体库的鉴定 将所构建的各种Fab抗体库混合成为最终的人源噬菌体抗体库，理论库容为1.97×107 实际的噬菌体抗体库滴度为3.9×1014cfu/ml。随机挑取10个菌落进行PCR，.电泳观察,双链阳性有5个(图3.6),单链（轻链或者重链）阳性有4个,空载体1个, Fab阳性率为50％左右。 * * 图3.6半合成抗体库Fab重组克隆的PCR鉴定 其中1，2，4，5，8五个克隆为轻重链双阳性克隆 M 1L 1H 2L 2H 3L 3H