培训课件--抗体工程制药.pptVIP

在基因工程药物、基因组药物和传统的抗体药物的研究与开发的基础上，应用基因组学、蛋白质组学、免疫组学、抗体组学、抗原表位组学和系统生物学的最新成果来研制抗体药物。 与传统抗体药物的研制相比，抗体组药物研制具有高通量、整体化、信息化和系统化的特点，一方面可以提高抗体药物研究与开发的速度，缩短药物研究与开发的周期，另一方面由于抗体组药物的筛选应用了基因芯片、蛋白芯片和组织芯片等技术，既可获得广谱的抗体药物，又可获得个性化的抗体药物。 作 业 1、名词解释：单链抗体、双功能抗体 2、简述单克隆抗体人源化改进的方法。 3、举例说明抗体导向治疗药物的研发方法。 四、噬菌体抗体库技术 ——phage antibody library定义： 通过PCR将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，并在噬菌体表面表达、分泌，经筛选后获得特异性抗体。 1、在噬菌体中表达免疫球蛋白基因的原理 大肠杆菌丝状噬菌体M13、fd、f1等，属于丝杆噬菌体科、丝杆噬菌体属，含一个单链环状DNA分子； DNA外螺旋状排列着5种外壳蛋白： 蛋白Ⅷ位于丝状噬菌体的管状部分； 蛋白Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅸ分别位于两端。 常将外源基因与外壳蛋白Ⅲ的基因连接，形成融合蛋白。 2、重组噬菌体生产抗体 从小鼠或人的B细胞中分离出mRNA； 反转录成cDNA； 设计两对特殊的引物，通过PCR将编码重链和轻链的cDNA扩增出来； 用特定的限制性内切酶酶解扩增出来的cDNA片段； cDNA片段克隆进入丝状噬菌体质粒载体中，与单链丝状噬菌体外壳蛋白Ⅲ或Ⅷ的基因连接形成融合基因； 经过辅助噬菌体感染后，抗体功能片段与外壳蛋白一起表达在重组丝状噬菌体的表面； 通过免疫亲和层析的方法或用ELISA的方法，筛选出抗原特异性抗体。 3、组合抗体文库技术 重链和轻链的cDNA都有各不相同的限制性内切酶酶切位点； 将每一序列（大量不同的抗体基因）都定向克隆进一单独的丝状噬菌体载体并在裂解循环中表达； 形成一个可以用以筛选特异抗原结合活性的组合丝状噬菌体文库。 哺乳动物的B细胞可以产生约106-108个不同的抗体； 一个噬菌体文库含有相同数量级的克隆； 因而一个抗体组合文库可以包括任何一种哺乳动物B细胞产生的各种抗体分子； 对混合文库中的克隆可以进行人工突变。 4、噬菌体抗体文库技术的优点 省去了单克隆抗体制备过程中许多费时费力的过程； 使Ab的制备由细胞水平进入到基因水平，为解决人源单克隆抗体的制备提供了新的途径； 重、轻链的随机组合提高了抗体的多样性。 5、Ab蛋白的附着型和分泌型表达 在丝状噬菌体的外壳蛋白Ⅲ基因和外源抗体蛋白基因之间引入一个琥珀突变密码子UAG； 当丝状噬菌体感染有琥珀突变抑制的大肠杆菌株(如SupE)时，UAG密码子被解读为G1u，Ab蛋白就以融合蛋白的形式附着于噬菌体表面； 在非琥珀突变抑制的大肠杆菌菌株中表达时，UAG密码子被解读为终止密码子，Ab蛋白以可溶性蛋白的形式被分泌到细菌体外。 6、抗体的表达系统 哺乳动物细胞表达 哺乳动物细胞是真核细胞； 具有对表达的蛋白进行正确的加工和翻译后修饰的能力； 可以将抗体分泌表达。 细菌表达 生产抗体分子片段最为有效的系统 表达的抗体分子不能糖基化、组装错误、不能形成正确的二硫键等 易形成不溶且不具活性的蛋白包涵体 酵母、植物细胞、昆虫细胞 7、随机多肽文库 ——又称人工合成抗原决定簇文库 人工合成构建编码随机肽段(一般在6—9肽之间)的基因； 噬菌体展示 ,构建一个多肽文库； 从文库中筛选能够模拟某些生物大分子生物功能与活性的短肽小分子。 EPO模拟小肽 随机合成8肽文库； 通过ELISA的方法，用EPO受体筛选； EPO模拟肽段的功能完全可以模拟EPO分子。 抗原抗体特异性结合，在体内和体外均可呈显某种反应。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，故抗体类药物可用于治疗。在体外，由于抗原性状和反应条件不同，可发生凝集或沉淀等可见反应，故可用已知抗体来鉴定抗原，做病原学诊断和血型测定，称为血清学鉴定。 一、抗体诊断试剂 抗体诊断药物基本分为三类：血清学鉴定用的和免疫标记技术用的抗体制剂，以及体内导向诊断药物。 4.4 抗体药物 1、血清学鉴定用的抗体类试剂 （1）鉴定病原菌用的抗体试剂 A、常用诊断血清的品种和用途 B、诊断血清的制备步骤 a、制备细菌抗原：细菌接种---培养---收集菌苔---制成菌液。 b、免疫动物和制备抗体血清：动物：家兔、马、羊、豚鼠。免疫途径：静脉、腹腔、皮下。接种次数3-7次，每次间隔3-4d，末次注射后6-8d取血样测效价，达到要求，即可采血，离心分离血清。 C、诊断