荧光分光光度法解析.pptVIP

B 分子的刚性和共平面性 荧光效率：0.2 1.0 C 取代基：给电子基团使荧光效率增大，如-OH、-OCH3、-NH2等。 吸电子基团使荧光效率减少，如-COOH、-NO2、-X。 中性基团对荧光效率影响不大。如-R、NH3+等。 四、影响荧光的外界因素 1、溶剂 A 溶剂的极性：极性越大， λem增大，荧光效率也增强。通常选择极性溶剂。 B 粘度：粘度系数越大，有利于荧光效率的提高。 2、温度 温度越高，碰撞机率大，效率减少。热淬灭 3、 pH值：酸度改变了弱酸弱碱的结构，从而使其荧光效率受到影响。 4、荧光熄灭剂：引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂。 OH- H+ OH- H+ 荧光熄灭：是指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子相互作用，引起荧光强度降低的现象。 碰撞熄灭：由于碰撞而损失能量 化学淬灭：荧光物与加入的物质发生反应，生成新的化合物。 体系间跨越：单线态变成三线态。 引起荧光熄灭的形式： 自熄灭现象：当荧光物质的浓度升高而产生。 荧光熄灭法：利用荧光强度的减小与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系来进行测定含量的方法。 F C 5、散射光的影响 引起光的散射原因有：比色皿表面，溶液内微粒，溶液内气泡。 散射类别：a 瑞利散射 b拉曼散射 散射光波长与荧光接近，对荧光强度测定有干扰，使其读数增大。 荧光光谱 散射光谱 502 461 410 346 — 氯仿 450 418 375 320 — 四氯化碳 499 458 408 344 267 环已烷 500 459 409 344 267 乙醇 511 469 416 350 271 水 436 405 365 313 248 溶剂 不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 * * * * * * 吸收 发射 第4章 荧光分析法 1、光致发光： 激发态电子回到低能级而伴随光的辐射 §1 概述 热、光 磷光 荧光 分子荧光 原子荧光 紫外线荧光 激发光源为紫外光 X-射线荧光 红外光荧光 分类： 2、荧光分光光度法：利用物质的荧光光谱进行行定性定量分析方法 。 F（强度）、λ 荧光分光光度计：用来测量荧光强度的仪器。 3、特点：灵敏度更高 10-10-10-12g/ml，应用不如UV广泛。 4、应用：①直接荧光光度法 ②作为HPLC的检测器（用的多） ③TLC定性、定量 §2 原理 一、分子荧光产生 1、分子的电子能级： π π* π π* ψ1 ψ2 ψ3 ψ4 三线态与单线态比较： ① 单线态 ②三线态 E2E1 ，ε2ε1， ② 的寿命可达1秒，而①的寿命为10-8，跃迁几率①是②的106倍。 基态单线态 激发态 UV 振动能级：物质分子中存在一系列电子能级，而每个电子能级中又包含一系列的振动和转动能级。 电子能级 振动能级 转动能级 2、荧光的产生 （1）振动弛豫：同一电子能级电子从高的振动能级到最低的振动能级。 原因：分子碰撞 结果：热能，无辐射 电子能级 振动能级 （2）内部能量的转移 电子能级 振动能级 产生原因：受激分子常由高电子能级以无辐射（热）跃迁方式转移至低电子能级。 （3）荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到基态的任一能级。 电子能级 振动能级 第一激发态 第二激发态 特点：荧光的能量小于激发光能量。 荧光发射所需时间为10-9~10-7s。 （4）外部能量的转移 这种不同物质间的能量转移现象，叫荧光淬灭（熄灭）。M叫荧光淬灭剂。 激发态分子与溶剂分子及其它溶质分子之间相互碰撞而失去能量，常以热能的形式放出。 外部能量转换可降低荧光强度。 （5）体系间的跨越 激发态分子的电子发生自旋反转，而使其多重性发生变化。激发单线态—激发三线态 发生条件：常需物质中含有重原子如Br、I等 电子能级 振动能级 分子由激发单线态跨越到三线态后，荧光强度减弱甚至熄灭。 （6）磷光：经过体系间跨越的分子降至三线态最低能级，跃迁至基态而发生的光。 吸光—单线态—弛豫—跨越—弛豫—基态—磷光 过程： 电子能级 振动能级 特点：（1）λ（磷光）λ（荧光） （2）寿命10-4—10s （3）室温下溶液很少呈现磷光 处于激发态的分子回基态的途径： ①发射荧光 ②发射磷光 ③内部能量转换④ 外部能量转换 其中以速度最快，激发态寿命最短的途径占优势。 V2 (a) (d) S0 V4 V1 V0 V3 （b） （b） V0 V0 S1* S2* V0 V1 V1 V1 V2 V2 V2 V3 V3 V3 V4 V4 V4 (c) (e) T1* (f) a