酿酒酵母ARS305侧翼序列对其自主复制活性的影响.docVIP

酿酒酵母ARS305侧翼序列对其自主复制活性的影响 　　摘要：利用PCR技术扩增了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ号染色体上以ARS（Autonomously replicating sequence，ARS）305为核心的不同长度侧翼序列，并将其构建到酵母整合型载体pRS405中获得了重组质粒PA500、PA1000、PA2000，然后通过电转化法转入酿酒酵母细胞中，测定了不同ARS305片段对酵母转化效率及质粒在酵母中稳定性。结果表明，并非侧翼序列越长ARS活性越高，重组质粒PA1000具有比PA2000更高转化频率和转化稳定性，推测ARS两侧序列存在一些顺式和反式的调控机制影响ARS自主复制功能。 　　关键词：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；ARS305；重组质粒；复制起始活性 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）19-4804-03 　　真核生物染色体中存在多个复制起始位点，能够使真核生物巨大的基因组在较短时间内完成复制。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的复制起始位点称为自主复制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），首次在酿酒酵母的TRPI基因紧密连锁DNA序列中发现，含有ARS的质粒转化酵母后能独立存在于宿主染色体外且能自主复制[1]。此后，Irene等[2]从酿酒酵母Ⅲ号染色体中共发现有19个ARS，约为150 bp，其中含有一段11 bp富含A/T的保守序列ACS[5′-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3′]。然而含有保守序列ACS的不同片段在ARS活性方面却表现出明显的差异，部分活性高的ARS却没有ACS保守序列[3]。说明DNA复制起始功能不仅由ACS保守序列决定，还需核心序列3′和5′侧翼序列的参与。 　　在酵母遗传工程中，不考虑载体-宿主系统的类型、外源基因产物的性质和工程菌的培养条件等因素，重组质粒的稳定性可以从功能上鉴定复制起始位点的活性。通过DNA重组技术将可能含有ARS的DNA片段构建到缺失复制起始位点的质粒后转入细胞，如果它有较高的细胞转化率并且表现为遗传不稳定性，就表明该片段在宿主菌中可能有复制起始位点活性[4]。本研究扩增了以ARS305为核心的不同长度侧翼序列，并将其构建到酵母整合型载体pRS405中，通过电转化法转入酿酒酵母细胞中，测定了不同ARS片段对酵母转化效率及质粒在酵母中稳定性，为后续以酵母作为模式生物研究真核基因的复制与转录机制提供了参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株和质粒 Esherichia coli DH5α为内蒙古科技大学生物工程与技术研究所基因工程实验室保藏。酿酒酵母YPH499（MATα ura3-52 lys2-801 anber ade2-101 ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、整合型载体pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Newlon教授馈赠。 　　1.1.2 试剂 DNA Marker，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶及PCR产物纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；Agarose购自Invitrogen公司；PCR引物合成及DNA测序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成；其他试剂药品为进口分析纯和生化试剂。 　　1.1.3 培养基 大肠杆菌的培养使用LB培养基（胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母浸提物5 g/L，固体培养基琼脂含量15 g/L）；酿酒酵母YPH499的培养使用YPD培养基（胰蛋白胨20 g/L，酵母浸提物10 g/L，高压灭菌20 min 后，加入100 mL灭菌的20 g/L葡萄糖溶液，固体培养基琼脂含量15 g/L）。SD 筛选培养基（1.34%YNB，2%葡萄糖，2%琼脂）；氨基酸（20 mg/L Trp，20 mg/L His，20 mg/L Lys）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 酵母基因组的提取 珠磨法提取：收集过夜培养16～18 h的酿酒酵母YPH499菌液，用TE洗涤2次溶于200 μL TE中；加入50 mg玻璃珠（直径0.3～0.5 mm）和100 μL酚∶氯仿（25∶24，V/V），漩涡振荡2～3 min；12 000 r/min离心2 min，取上清，加入等体积酚∶氯仿（25∶24，V/V），抽提后12 000 r/min离心5 min；取上清，加入0.5 μL RNaseA，37 ℃温浴30 min；加入2倍体积无水乙醇，-20 ℃静置30 min；10 000