池蝶蚌与三角帆蚌不同组织SOD及EST同工酶的比较研究.docVIP

池蝶蚌与三角帆蚌不同组织SOD及EST同工酶的比较研究 　　摘要：采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳法研究池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）和三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）5种组织（鳃、外套膜、肠、闭壳肌和斧足）中SOD和EST同工酶的表达情况。结果表明，两种蚌的SOD和EST同工酶均具有明显的组织特异性。SOD、EST酶谱间存在不同程度的种间差异，可作为鉴定池蝶蚌与三角帆蚌的遗传标记。 　　关键词：池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）；三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）；同工酶；电泳；组织特异性 　　中图分类号：S917.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3615-04 　　池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）为同属不同种，池蝶蚌原产于日本滋贺县琵琶湖。20世纪90年代，中国从日本引进亲蚌繁殖驯养成功[1]。同工酶酶谱技术在水产领域得到了广泛的应用[2-7]。有关池蝶蚌和三角帆蚌的生物学特性研究已有相关报道[8]，而关于同工酶的比较研究少见报道。本研究以池蝶蚌和三角帆蚌的不同组织为材料，对SOD、EST同工酶进行了初步研究，探讨SOD、EST同工酶酶谱表现模式。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　池蝶蚌与三角帆蚌均采自常德市东江珍珠养殖场。 　　1.2 方法 　　1.2.1 样品的制备 将池碟蚌和三角帆蚌在预冷的解剖盘上迅速进行活体解剖，剖取外套膜、闭壳肌、斧足、鳃和肠5种组织，用预冷的生理盐水洗两次，在预冷的玻璃研钵中充分匀浆，并加入3～4 mL预冷的生理盐水。把匀浆液用移液枪转入1.5 mL的离心管中在5417C/R型高速冷冻离心机上离心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），离心2次以上，取上清液即粗酶液分装于编号的离心管中，置于-20 ℃冰箱中保存备用。 　　1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳 参照文献[9]进行聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳。采用DYY-III-5型稳压稳流电泳仪，整个电泳过程在 0～4 ℃的环境下进行。用移液枪吸取30 μL粗酶液和25 μL预冷的40%蔗糖溶液，再加入少许的溴酚蓝作为指示剂，每个样品槽中点样30 μL。EST同工酶采用稳压进行电泳，开始时将电压调至250 V，大约50 min后，溴酚蓝指示剂进入分离胶，将电压调至200 V电泳[10]，整个电泳过程大约6～8 h。 　　1.2.3 染色与拍照 　　1）SOD同工酶。将凝胶板浸泡在2.45×10-3 mol/L NBT溶液中15 min，然后转移到含有0.028 mol/L TEMED、2.8×10-5 mol/L核黄素的0.036 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8）中浸泡5 min，最后将凝胶放在0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.8）和1×10-4 mol/L EDTA溶液中光照到显色，并采用Gelpro型凝胶成像系统进行拍摄与分析。 　　2）EST同工酶。以醋酸萘酯做底物，加入坚牢蓝和 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.4）[11]中，在37 ℃恒温箱中进行染色，直到有清晰的酶带出现，染色时间30 min，并采用Gelpro型凝胶成像系统进行拍摄与分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶分析结果 　　池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶电泳结果见图1。在两种蚌的5种组织中分离出3条SOD同工酶带，显示出两种蚌SOD同工酶的丰富多样性和组织特异性，SOD同工酶在两种蚌的不同组织中表达强度不同，在斧足组织中表达最强，鳃、肠中次之，外套膜中最弱。在两种蚌的同一组织中，SOD同工酶的表达也有差别。 　　池蝶蚌和三角帆蚌SOD同工酶表达酶谱见图2。按迁移率的快慢， 以向阳极方向运动最快的酶带编为SOD-1，由阳极向阴极方向依次编号为SOD-2、SOD-3，其中SOD-1在两种蚌的5种组织器官都有出现，活性也相当， SOD-2仅在两种蚌的斧足中出现。以颜色深浅表示酶带强弱，黑色表示强带，白色表示弱带，颜色越深酶活性越强。 　　根据Gelpro型凝胶成像分析系统分析显示，SOD同工酶在池蝶蚌和三角帆蚌5种组织中的表达情况见表1。从图1、图2和表1可以看出， 在池蝶蚌和三角帆蚌所有被分析的组织中均有SOD同工酶酶带检出，两种蚌的SOD同工酶的表达既呈现出一些相似的特征，又有明显差异。两种蚌的斧足中表达出3条带分别为SOD-1、SOD-2和SOD-3，肠中有2条带分别为SOD-1和SOD-3。池蝶蚌的鳃和闭壳肌中都只有SOD-1表达，而外套膜中有SOD-1和SOD-3表达；三角帆蚌的鳃和闭壳肌中均有S