小麥抗旱基因TANAC69的重组分子的构建及筛选鉴定.docxVIP

小麦抗旱基因TANAC69的重组分子的构建及筛选鉴定 1，获取目的基因(试剂盒法)（TRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，TRIZOL在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性） 样品处理：取?50-100mg?组织（新鲜或?-70?℃?及液氮中保存的组织均可） 置于1.5ml?离心管中，加入?1ml?Trizol?充分匀浆，室温静置5min?。?? （2）加入?0.2ml?氯仿，振荡?15s，静置?2min?。? （3）4℃?离心，?12000g×15min?，取上清。（氯仿抽提蛋白，异丙醇沉淀RNA，乙醇洗涤）? （4） 加入?0.5ml?异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置?10min?。?? （5）4℃?离心，?12000g×10min?，弃上清。?? （6）加入?1ml?75%?乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃ ，7500g×5min?，弃上清。? （7）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；? （8）用Rnase-free?water?溶解RNA沉淀。（不含水的RNA酶溶解RNA沉淀） 2，设计引物（长度一般为16-30bp，最佳为20-24bp，两个引物间不应发生互补避免形成引物二聚体） 目标序列中酶的识别位点，(用DNMAN找出目标序列中的酶的识别位点) AluI, AlwI, BssHII, CfoI, EcoRI, HaeIII,