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RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction) PCR (Polymerase Chain Reaction) 1. What is PCR? PCR is an in vitro method of DNA synthesis by which a particular fragment of DNA can be specifically amplified. 2 Background knowledge of PCR: DNA replication DNA denaturation, renaturation hybridization DNA Replication: DNA Denaturation Renaturation: Hybridization 3 Principles of PCR 高温变性 低温退火 适温延伸 循环25-30次 4 The Characteristics of PCR High specificity High sensitivity Simple and rapid operation Wide applicability 引物设计的原则 引物长度：15-30bp 引物中碱基分布：尽可能随机分布，G+C占45%～55% 引物自身不能互补 引物之间不能互补 引物与非扩增区同源性70%，3‘末端连续8个碱基不能与待扩增区以外序列完全互补 引物3‘端碱基一定要与模板互补，最好选择G和C 引物5‘端可游离十几个碱基，可进行修饰 Simple and rapid operation Wide applicability 5 The Composition of PCR System: DNA聚合酶（DNA polymerase） 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 的Klenow片段； 6. Standard PCR reaction: 几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 Heat for 5 min at 95℃ to make the template DNA denaturated completely. Cycle parameters： 95 ℃ 50 sec 60 ℃ 45 sec 72 ℃ 50 sec Cycle times: 30 Finally, incubate for 10 min at 72 ℃ to make all DNA fragments polymerize completely. reaction procedures detect the amplified DNA molecule by gel electrophoresis * * 操 作 (一)细胞总RNA的提取 1、取小鼠肝脏约0.1g（约绿豆大小），置匀浆器中，加入1ml TRIzol，充分匀浆。 2、将匀浆后样品转入Ep管，离心数秒，取250ul上清至一新Ep管中。 3、每管样品中加入50ul氯仿（萃取酚），充分振荡混匀，静置10min。 4、12000rpm×10min。 5、取上清转入新Epg管，加等体积异丙醇，混匀，室温放置10min。 6、12000rpm×10min。 7、弃上清，加入50ul 70%乙醇洗涤一次，自然晾干。 8、加入50ul DEPC水溶解沉淀。 (二)逆转录反应（总体积20 ul ） RNA (1～4ug) 2 ul Oligo dT 1 ul DEPC处理的ddH2O 5 ul 70℃反应5分钟，迅速置于冰上5分钟 5×buffer 4 ul 10mM dNTP 4 ul 42℃预热5分钟 逆转录酶AMV 2 ul RNasin 2 ul 42℃水浴1小时 72℃水浴10分钟 冰上放置备用 (三)PCR扩增（总体积30 ul ） ddH2O 15.5 ul 10×Buffer 3 ul Mgcl2 (1.5mmol/L) 2.5 ul dNTPs
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