核酸分子杂交技与应用综述.docx

核酸分子杂交技术与应用综述摘要 核酸分子杂交技术是20世纪70年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它是基于DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针与待测样品的DNA/RNA形成杂交分子的过程。分子杂交实验依据其形式的不同可以分为液相杂交、固相杂交、原位杂交，而固相杂交又可以分为菌落杂交、点/狭缝杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。各类型杂交稻基本原理和步骤是基本相同的，只是选用的杂交原材料、点样方法有所不同。关键字 核酸分子杂交 液相杂交 固相杂交 原位杂交 应用 本文是对分子杂交技术的原理和类型分类及其应用的一篇综述。旨在了解各种杂交类型的应用方向，即在生物、医学上的应用。核酸分子杂交原理DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度Tm。Tm值得大小取决于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其Tm值越高。因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键。变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。核酸分子杂交类型（一） 固相杂交固相杂交是把欲检测的核酸样品先结合到某种固相支持物上，再与溶解于溶液中的杂家探针进行反应，杂交结果可用仪器进行检测，但大多数情况下直接进行放射自显影，然后根据自显影图谱分析杂交结果。菌落杂交用于重组细菌克隆筛选的固相杂交，称作菌落杂交。主要步骤包括菌落平板培养、滤膜灭菌后放到细菌平板上，使菌落粘附到滤膜上，将滤膜放到经适当溶液饱和度吸水纸上，菌斑溶解产生单链的DNA，固定DNA用32P标记的单链探针与菌落DNA进行杂交。杂交后，洗脱未结合的探针，将滤膜暴露于X线胶片进行放射自显影。将自显影胶片、滤膜、培养平板比较就可以确定阳性菌落。Southern杂交Southern杂交是从环境样品中提取细菌总DNA，用适当的限制性核酸内切酶切割，经凝胶电泳分离后，将凝胶中的条带转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后对该膜进行探针检测的方法。只有含有靶DNA序列的DNA分子才能与特定的核酸探针进行杂交。Southern杂交主要用于研究某些细菌多态性变化规律。Northern印记杂交Northern印记杂交和Southern印记杂交的过程基本相同，区别在于靶核酸是RNA而非DNA。RNA在电泳前已经变性，进一步经历变性凝胶电泳分离后，不再进行变性处理。在Northern杂交中所使用的探针常常是克隆的基因。（二） 液相杂交液相杂交是一种研究最早且操作简便的杂交类型。液相杂交的反应原理和反应条件与固相杂交基本相同，仅仅是将待检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行反应，然后利用羟磷灰石柱选择性结合单链或双链核酸的性质分离杂化双链和未参加反应的探针，用仪器计数并通过计数分析杂交结果，或者利用核酸分子的减色性（260nm处吸光度的降低与双链形成去的多少成正比）分析杂交的结果。（三） 原位杂交原位杂交是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成杂交体，然后应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术。其中在此技术上发展的荧光原位杂交（FISH）技术因其经济、安全、无污染、探针稳定、快速、简便、直观、可靠、灵敏度高、信号强、背景低等，在诊断生物学、发育生物学、细胞生物学、遗传学和病理学研究上均得到广泛的应用。核酸分子杂交技术应用（1） Southern印记杂交单基因遗传病的基因诊断：早在1978年，简悦威等医学家在镰状细胞贫血症的基因诊断中就采用过Southern杂交的方法，取得了基因诊断的突破。基因点突变的检测：例如ATP敏感性钾离子通道的亚单位内向整流钾通道基因A635G突变的检测Northern印记杂交Northern印记技术多用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录以及转录的相对水平。目前，Northern印记技术仍然被认为是检测基因表达水平的金标准。（3） 液相杂交以液相杂交技术为