杜仲成分的提取與分离.docVIP

一 杜仲是我国特有的一种传统的名贵中药材，具 有降血压、降血脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗病 毒、抗炎、抗菌、增强机体免疫力、治疗心血管疾病 等生物活性，其药用价值历来受到人们的关注[1]。在 早期的报道中主要是针对杜仲皮的研究，但是杜仲 皮取材困难、成本高。大量现代医学研究证实了杜 仲叶与皮的化学成分基本一致，具有同等功效，特 别是绿原酸和黄酮的含量远高于皮中的含量，因 此，对产量高、价格便宜的杜仲叶中有效成分进行 研究具有一定的实用价值。笔者研究NKA- Ⅱ树脂 对杜仲叶中绿原酸和黄酮类化合物吸附和分离的 效果，并对其分离工艺进行优化，以期为杜仲叶相 关产品的深开发与生产提供参考。 4 二 ，Heidolph 旋转蒸发仪，UNICO UV- 2102 PC 型分光光度计；芦丁标准品、绿原 酸标准品（中国药品生物制品检定所），其它试剂均 为分析纯。 1.2 样品预处理及测定方法 1.2.1 样品预处理用70%乙醇水溶液作为提取 剂，按照料液比1∶12，pH 值为4，每次提取25 min，提取3 次，合并滤液并浓缩至无醇味后，冷冻 干燥，得到杜仲叶粗提物，在干燥避光条件下保存。 1.2.2 绿原酸及总黄酮的测定紫外可见分光光 度法测定绿原酸的含量[3]和总黄酮的含量[2]。 1.2.3 高效液相色谱法（HPLC）检测杜仲叶分离产 物色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7μm）（美国WATERS 公司）； 柱温25℃；流速0.35 mL/min；检测波长365 nm；进 样量5 μL；流动相采用梯度洗脱。 1.3 树脂的选择 采用9 种大孔吸附树脂对杜仲叶中绿原酸、总 黄酮的吸附- 解吸分离性能进行研究，可为规模化 分离绿原酸、总黄酮提供理论依据。 1.4 大孔树脂预处理 先将各种树脂分别用蒸馏水溶胀12 h 后浮 选，然后用95%乙醇浸泡24 h 后，用蒸馏水洗至无 浑浊现象，无醇味为止。再用1 mol/L NaOH 溶液浸 泡24 h，用蒸馏水洗至中性。然后用1 mol/L HCl 浸 泡24 h，用蒸馏水洗至中性。最后用20%乙醇浸泡 储备。 1.5 静态吸附-解吸试验 首先对9 种大孔树脂的吸附量、吸附率和解吸 率进行测定[5]，其次分别考察吸附液pH 值和不同 乙醇浓度对NKA- Ⅱ树脂静态吸附的影响[6]。 1.6 动态吸附-洗脱试验 在室温下，根据静态吸附- 解吸试验的条件, 考察上柱液流速、上柱液浓度、洗脱剂流速对 NKA- Ⅱ树脂动态吸附- 洗脱性能的影响，作动态 吸附曲线和洗脱曲线，确定最佳动态吸附- 洗脱工 艺条件。 1.7 扩大试验及高效液相色谱检测 称取5 kg 杜仲叶，先用NKA- Ⅱ大孔树脂进行 分离，将30%、50%、70%的乙醇洗脱液分别浓缩， 再用聚酰胺树脂和Sephadex LH- 20 树脂进行纯 化，最后将分离纯化的产物进行高效液相色谱检 测，操作条件见1.2.3。 2 结果与分析 2.1 大孔树脂的静态吸附-解吸试验 2.1.1 大孔吸附树脂对绿原酸、总黄酮的静态吸附 效果比较试验所用树脂有极性、弱极性、非极性 三种类型，这9 种大孔吸附树脂对绿原酸、总黄酮 的静态吸附- 解吸情况见表2。 从表2 可以看出，NKA- Ⅱ在静态饱和吸附时 对绿原酸、总黄酮不仅具有较高的吸附量，而且解 吸率也较高，所以确定NKA- Ⅱ为最佳树脂，并进 行动态吸附- 洗脱试验。 2.1.2 NKA- Ⅱ树脂对绿原酸、总黄酮的静态吸附 动力学曲线在给予充分时间吸附的情况下，由图 1 可见，绿原酸和总黄酮在NKA- Ⅱ树脂上的动力 第12 期张玲等：杜仲叶绿原酸总黄酮的分离纯化及检测123 表3 上柱液浓度对NKA-Ⅱ树脂动态吸附性能的影响 上样液 浓度 1/20C0 图4 不同乙醇浓度对NKA-Ⅱ树脂静态解吸的影响 学过程如下：在起始阶段吸附速率较大；但4 h 之 后，树脂基本达到吸附平衡；随着吸附时间的继续 延长，吸附量的增加速率减小。根据吸附动力学曲 线，NKA- Ⅱ树脂对杜仲叶粗提物中绿原酸和总黄 酮的吸附属于快速平衡型树脂。 2.1.3 吸附等温线将浓度为C0 的杜仲叶粗提物 溶液（含绿原酸3.734 mg/mL 和总黄酮14.018 mg/mL） 分别稀释成不同浓度的静态吸附液，称取 5.000 g（干基）的NKA- Ⅱ树脂，振荡条件同文献[4]， 计算吸附率，作吸附等温线，结果见图2。 吸附等温线的初始阶段几乎呈线性的，表明低 浓度上样液中的活性成分可以在树脂中高度扩散。 当树脂表面形成分子层吸附饱和后，溶液中的黄酮 化合物在外层再以氢键的方式与表面吸附的黄酮 吸附，但由于孔容的限制，所以存在一个极限，这与 李云志等[7]和李莹等[8]