植物總DNA的提取.docVIP

PAGE PAGE 6 核酸的分离、提取、鉴定与扩增 一．植物总DNA的提取 [实验目的] 核酸的分离纯化是核酸制备及分析的前提和基础，通过本实验将学会和掌握核酸制备的一些基本操作和方法，通过电泳等实验技术研究核酸的性质，同时掌握用PCR技术分析不同材料之间亲缘关系的方法。 [实验原理] 由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验采用CTAB法提取竹子、香樟的DNA。 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下， 结合 65℃ 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿 / 异戊醇 (24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA [实验器材] 1、冰箱 2、恒温水浴锅 3、高速离心机 4、陶瓷研钵和杵子 5、离心管 6、植物材料 7、微量加样器 [实验试剂]1．十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris）3．乙二胺四乙酸（EDTA）4. 氯化钠5．2-巯基乙醇6. 无水乙醇7. 氯仿8. 异戊醇 [实验步骤] 1、分别称取2g新鲜的竹子、香樟叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），保温30Min，每5min轻轻震荡几次。 5. 冷却2 min后，加入等体积氯仿振荡2~3 min，使两者混合均匀；4、 10000 rpm离心10 min，移液器轻轻地吸取上清液至另一新的灭菌离心管中；5、 加入2/3倍体积的异丙醇，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合室温放置15min至能见到DNA絮状物；6、 10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出7、 加入800 μl 75--80%的乙醇（均可以），洗涤DNA；8、 10000 rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；9、 加入50 μl 双蒸水，使DNA溶解。 10、提取的DNA样品跑电泳，电泳图如下 [实验结果] 样孔②为竹子，样孔③为香樟 由图看出DNA提取浓度不太高，可能是液氮研磨时放置太久所致 [注意事项] 1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。 2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 [思考题] CTAB、的作用是什么？ 答： CTAB可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。 液氮研磨的原理是什么？ 答：液氮变为气体时要吸收大量的热，使叶片瞬间冷冻。这样研磨起来就更彻底，更重要的是这种冷冻的方法不会破坏叶片细胞内所含的物质的形态。 二、 PCR基因扩增 　PCR技术是在1985年由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明的聚合酶链反应。这一技术具有划时代意义的。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 [实验目的] 学习和掌握PCR反应的基本原理与实验技术。 [实验原理] 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction , PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃ 退火：使溶液温度降至50~60℃ 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5′→3′ 上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。