研究性學习(探究组培中玫瑰外植体的灭菌方法).docVIP

PAGE PAGE 1 研学论文 课题题目：探究组培中玫瑰外植体的灭菌方法 摘 要 如何给原代外植体灭菌，已经成为众所周知的事情，但如何使用无毒或低毒的药品在学校等对安全需求较高的场所为外植体进行灭菌，却因为此事涉及众多方面而很难查到准确的数据。为了寻找一种适用于学校的原代外植体灭菌方式，我们决定对此一探。我们以玫瑰芽为外植体作为主要的研究材料，以不同消毒药品种类、不同消毒药品浓度、不同灭菌时间为主要变量展开研究。消毒液对细菌和植株同时产生杀伤作用，而以上三种变量正是用来调控这两种杀伤作用的主要变量。如何均衡消毒液对于二者的杀伤作用，找到一种能杀菌又不伤害到植物细胞的灭菌方法，正是我们的主要研究任务。使外植体能够得以存活，而灭菌效果达到最佳。 关键词：组织培养 原代外植体 灭菌 污染 课题的提出 在课外的组培课上，老师讲到了原代培养。原代培养的优点就是不会使原来植株的优良性状丧失。原代培养的灭菌药品是升汞（HgCl2），升汞的灭菌特点是效果好，灭菌过程易于控制，但是升汞有剧毒，出于对同学安全考虑，老师只能选择放弃原代培养而选用会使原代植株的优良性状部分丧失的继代培养。这使我们想到能不能在不使用升汞的条件下，寻找一种可行的灭菌方式。消毒液要能适合学生使用，对人体无毒，使用相对安全；灭菌时间和消毒液浓度要刚好达到灭菌效果而不至于对外植体产生过大的影响。将这种灭菌方式应用到学校的组培课上，改变我校只能用无菌外植体的继代培养的现状。 研究内容和方法 2 实验原理及设计 2.1 实验的理论依据 1.植物组织培养中，细胞具有全能性。 2.灭菌的原理是，在短时间内，灭菌药品对植物无害或只对外植体的外层 产生伤害，而使微生物（如细菌、真菌等）单细胞单体或群体的细胞膜结构 遭到破坏，从而达到灭菌效果。 3.次氯酸钠（NaClO）与双氧水（H2O2）的灭菌效果仅次于升汞。 2.2 实验设计原理 为了寻找三个自变量与灭菌效果的影响，必须先控制其中的两个变量，探究另一个变量与灭菌效果的影响。最后综合三方面因素综合考虑，得到结论。 首先将实验分为两大组，即次氯酸钠（NaClO）组与双氧水（H2O2）组，在每一组里划分浓度梯度，在每一个浓度的级别中设定几个时间，保证每一组里每一个浓度级别所对应的几个时间值相同。灭菌药品的浓度上升，对外植体与微生物的杀伤力都增大，时间的增加也会同时加大对外植体与微生物的伤害。由于灭菌药品的浓度的变化与灭菌时间的变化对两者伤害的改变程度不同，所以总会有一个相对应的浓度范围与时间范围，使灭菌药品对外植体与微生物的杀伤力达到均衡，即，能够有效地灭菌，且外植体不会受到太大的损伤。 在多次的试验中逐渐地缩小浓度与时间的范围，直到得到的范围可以在实际中应用为止。 3 第一阶段实验过程 3.1 实验分组 分组见表1所示 表1 第一阶段实验分组 灭菌药品 浓度 灭菌时间 实验瓶数 1 NaClO 2% 10min 3瓶 2 NaClO 5% 10min 3瓶 3 NaClO 10% 10min 3瓶 4 NaClO 2% 20min 3瓶 5 NaClO 5% 20min 3瓶 6 NaClO 10% 20min 3瓶 7 H2O2 5% 10min 4瓶 8 H2O2 10% 10min 4瓶 9 H2O2 5% 20min 4瓶 10 H2O2 10% 20min 4瓶 3.2 实验过程 采集玫瑰顶芽与侧芽并将采集来的经过筛选的植株放在漏网中，摊开，用流动的自来水连续冲洗30min。用洗涤灵逐一刷洗植株，并再次用自来水连续冲洗5min。用75%的酒精冲洗3min，最后用蒸馏水冲洗3次。封存在无菌水瓶里。（预处理阶段） 配制MS培养基4L 按照计划配制消毒药品 选择大小适中的外植体，按照时间进行灭菌。 接种 恒温培养。 3.3 实验后一周的观察记录及分析 3.3.1 观察记录 H2O2组无论何种浓度何种时间，培养基表面都已有大小不等的污染区，高浓度的外植体已经发黑。 NaClO组：2%10min组的三瓶已经出现污染。 10%10min与20min的外植体已经发黑。 其余瓶中还未出现明显的变化。 3.3.2 1、培养基表面都已有大小不等的污染区，说明低浓度H2O2的消毒能力，不足以把外来的细菌杀干净；外植体发黑说明高浓度的还会对外植体产生伤害。即，在提高双氧水的浓度时，它对微生物的杀伤能力在提高。但当双氧水的浓度还未提高到可以杀死足够多的微生物，使外植体得以产生愈伤组织的时候，双氧水对外植体的杀伤作用已经使外植体无法存活。所以排除掉双氧水作为原代外植体灭菌药品的可能性。2、NaClO中相对低浓度且低时间组的