α-法尼烯合成 载体构建 遗传转化 western杂交 丰产梨论文.docVIP

α-法尼烯合成酶论文：α-法尼烯合成酶基因转化丰产梨的研究 【中文摘要】α-法尼烯是一种存在于生物体中的倍半萜类物质,已知与植物的抗冷性、昆虫的诱导及冷藏苹果和梨果实重大生理病害-虎皮病的发生有关,是苹果果实中重要的香气成分之一。α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,α-法尼烯合成酶是调控α-法尼烯合成的关键酶,催化FPP转变为α-法尼烯。本实验根据Genbank中注册的α-法尼烯合成酶基因全长序列设计特定引物,利用荧光定量PCR和Western杂交的方法,鉴定初步获得转基因植株,并研究了生理特性。主要结果如下:(1)构建了pBI-AFS反义和RNAi表达载体,并转化丰产梨,得到转AFS基因的丰产梨植株。(2)以丰产梨组培苗为材料,优化了丰产梨组培苗的生根及遗传转化体系,并成功将转基因组培苗驯化移栽。最适宜丰产梨继代的培养基为MS+BA1.0mg/L +IBA0.2mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.0g/L,生根培养基为1/2 MS+ IBA0.3mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.0g/L.(3)转基因植株经过RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,野生型中α-法尼烯合成酶基因的相对表达量最高,反义转化植株中有所降低,RN... 【英文摘要】α-Farnesene, an acyclic sesquiterpene hydrocarbon that existed in organisms, has been proved to play an important role in attraction of codling moth chilling injury and development of scald on cold-storage apples. As one of aroma related volatiles in apple fruit,α-farnesene appears to be predominantly through classical mevalonate pathway.α-farnesene synthase (AFS) is the final, rate-limiting enzyme that converts farnesyl diphosphate (FPP) toα- farnesene in the mevalonic acid (MVA) pathway of terpene biosynt... 【关键词】α-法尼烯合成酶 载体构建 遗传转化 western杂交 丰产梨 【英文关键词】α-farnesene synthase Vector construction genetic tansformation Westernblot ‘Fertility’pear 【目录】α-法尼烯合成酶基因转化丰产梨的研究 中文摘要 8-9 英文摘要 9 1 前言 10-25 1.1 虎皮病与α-法尼烯 10-14 1.1.1 虎皮病的研究进展 10-11 1.1.2 α-法尼烯的代谢途径 11-14 1.2 虎皮病的防治 14-16 1.3 RNA 干扰 16-20 1.3.1 RNAi 的产生和发展 16-17 1.3.2 RNAi 与其他基因表达抑制技术的比较 17 1.3.3 RNAi 的作用机制 17-18 1.3.4 RNAi 表达载体的构建设计原则 18-19 1.3.5 RNAi 技术的应用 19-20 1.4 反义RNA 技术 20-22 1.4.1 反义RNA 技术的原理及作用机制 20-21 1.4.2 反义RNA 技术在植物上的应用 21-22 1.5 实时荧光定量PCR 技术 22-25 1.5.1 实时荧光定量PCR 技术原理 22 1.5.2 实时荧光定量PCR 技术 22-23 1.5.3 实时荧光定量PCR 研究进展 23-25 2 材料与方法 25-44 2.1 实验材料 25 2.1.1 植物材料 25 2.1.2 菌株与质粒 25 2.1.3 酶及生化试剂 25 2.1.4 PCR 引物 25 2.2 实验方法 25-44 2.2.1 植物表达载体的构建 25-27 2.2.2 RNAi 表达载体PBI-L-S 的构建 27-31 2.2.3 反义表达载体PBI-L 的构建 31-32 2.2.4 Trizol 法提取苹果总RNA 32-33 2.2.5 RNA 反转录 33 2.2.6 PCR 检测转基因植株 33-35 2.2.7 转基因植株表达量分析 35-36 2.2.8 转基因植株的Western 检测 36-41 2.2.9 转基因丰产梨组培苗的驯化移栽 41-42 2.2.10 转基因丰产梨抗高温指标测