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单抗 多抗 多克隆抗体 单克隆抗体 来源 小鼠，大鼠，兔子，羊等 鼠源性，兔源性 特点 来源广泛，制备容易 纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应 操作时要使两玻璃对齐，左、右、底三边无间隙，尤其注意底边平齐，以免漏胶。 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，要带手套并小心操作。 灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度，操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水或饱和正丁醇液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 室温25℃下凝胶完全聚合约需30-60min。 积层/浓缩胶（4%）的配制 总体积：2ml ddH2O 1.4 ml 30%储备胶 0.33 ml 1M Tris-HCl (pH 6.8) 0.25 ml 10%SDS 0.02 ml 10%AP 0.02 ml 混匀后 最后加TEMED 2 μl 将混合液迅速加入玻璃板间隙，并立即插入梳子 插梳子时要使梳子保持水平并小心避免混入气泡。 由于胶凝固时体积会收缩减小，会使加样孔变形，所以在浓缩胶凝固的过程中要不断补充浓缩胶溶液使之充满梳子间的空隙。 2?SDS上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，?-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。 (缓冲液中溴酚兰染料，使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；甘油还能够增大样品密度，以确保样品均匀进入样品孔内；SDS使蛋白变性并带上负电荷；?-巯基乙醇还原蛋白。) 如果蛋白浓度偏低则选择 5?SDS电泳上样缓冲液 蛋白样品与上样缓冲液（5x）按4:1的比例混合后，放在100℃加热器中 加热3-5min（提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，离心，一周 内要做的存至-20℃，一个月内要做的放于-80 ℃冰箱。 为了防爆管可在离心管上放 冰块。 四、电泳 1、将胶板装入电泳槽中，拔出样品梳（拔出来尽量小心,不要破坏加样孔, 如有胶丝可 用毛细血管枪头挑出），清洗泳道。 2、将样品放置在冰上，融化后先离心，然后在振荡器上混匀，上样，上样量10-50ug，一孔加marker，在边缘孔中加入等体积的１Ｘ上样缓冲液 ，以避免边缘效应。 3、在电泳槽内加入足够的电泳液，插好电极，打开电泳仪电源，以60v电压开始跑分离胶，到分离胶时，以80-120v跑胶，电泳至溴酚蓝到胶的边缘时结束。 注意： 1、电泳过程中随时检查内槽的电泳液是否会漏，槽应清洗干净，电极棒注意不能有结晶，线不能绕。 2、为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳；上样总体积建议为10-15 μL，尽量不要超过25 μＬ。 3、加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。 4、为了获得更好的重复性，可配10Ｘ或5X电泳液母液，用时再稀释。 5、由于变性完的蛋白放在冰箱中会发生复性，所以每次上样前都要进行变性３分钟。 6、电泳前可先用10V预电泳10min使条带更平整。 80V 100V 浓缩胶 分离胶 蓝色预染中分子量蛋白Marker 电 泳 最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-甘氨酸组成。缓冲液可以包含0.1%去污剂，通常是SDS。 Tris-甘氨酸凝胶可用于分离很宽分子量范围（6-200KD）的蛋白质，并可与变性或非变性条件相容。 Tris-tricine最适于分离小分子蛋白质（10KD）, 加样之前还需要还原变性。 Tris-乙酸缓冲液有时被用来分离大分子蛋白。 凝胶电泳缓冲液 Tris-tricine缓冲液 配方：100 mM Tris， 100 mM Tricine，0.1%SDS 蛋白分子量很大时（150KD），转膜液加0.1%SDS促使跑快点。 但是由于SDS干扰蛋白与膜的结合，故不能加太多。 一般在0.025-0.1%。 (SDS有助于大分子量蛋白从凝胶剥离) 高分子量恒流好，低分子量恒压好，因为高分子量要跑比较久，恒压跑的话跑久电流会往下降。 1. 称量Tris 48