酶联免疫吸附试验（elisa）.ppt

酶联免疫吸附试验（ELISA） 分子医学实验平台 教学内容 抗原抗体反应的一般特点、影响因素、应用； 免疫标记技术的常用分类、应用； 酶联免疫吸附试验的基本原理； 酶联免疫吸附试验的主要类型：直接法、间接法、夹心法、竞争法、捕获法、生物素-亲和素ELISA法等，介绍原理及主要用途； 酶标仪的使用； 使用微量移液器配制不同浓度液体。 一、血清学反应和免疫标记技术 二、酶免疫技术——ELISA 三、ELISA间接法 一、血清学反应和免疫标记技术 1. 血清学反应 2. 免疫标记技术 1. 血清学反应 即Ag和Ab在体外进行的特异性结合反应。 ⑴一般特点 ⑵影响因素 ⑶应用 ⑷分类 ⑴血清学反应的一般特点 特异性 可逆性 比例性 阶段性 特异性 Ag与Ab的结合发生在Ag表位与Ab的抗原结合位点之间。化学结构和空间构型呈互补关系，具有高度特异性。 可逆性 Ag与Ab通过非共价键（如范德华力、静电引力、氢键及疏水作用等）结合。 解离后的Ag或Ab均能保持原有的结构和活性。 解离程度主要取决于Ag、Ab互补程度。 比例性 Ag、Ab比例适当时才会出现可见反应。 阶段性 阶段 是否可见 反应时间 第一 否 数秒至数分钟 第二 是 数分钟至数日 两阶段间无严格界限，常受电解质、温度、 pH等诸多外界因素的影响。 ⑵血清学反应的影响因素 电解质： Ag与Ab结合失去亲水性，易受电解质作用发生凝集或沉淀反应 。 温度： 温度升高加速反应，常用37℃、4℃ 酸碱度： 通常pH6~8 ⑶血清学反应的应用 用已知Ag(Ab)检测未知Ab(Ag) 例如： 鉴定病原微生物 ——用已知Ab检测未知Ag 诊断传染病 ——用已知Ab(Ag)检测未知Ag(Ab) ⑶血清学反应的分类 2. 免疫标记技术 免疫标记技术是用标记物标记已知Ag（或Ab）进行的Ag、Ab反应。 通过检测标记物来反映Ag、Ab反应的情况，从而间接地测出被检Ag或Ab的存在与否或量的多少。 常用的标记物有荧光素、酶、放射性核素及胶体金等。 免疫标记技术 常用免疫标记物质 二、酶免疫技术—ELISA 1.技术要点： 抗原或抗体的固相化 酶标记Ag或Ab 底物显色 （1）固相载体 可与Ag(Ab)等大分子蛋白结合 结合容量高，结合稳定 生物大分子固化后仍保持活性 固化方法简便易行，快捷经济 （2）酶与酶作用底物 酶活性高 标记后酶活性稳定，且不影响标记Ag与Ab的免疫反应性 酶催化底物后信号易判定或测定 酶活性不受样品中其他成分的影响 酶、辅助因子及底物理化性质稳定、安全无害、廉价 常用酶及其底物 辣根过氧化物酶(HRP) 常用底物： 名称 简写 显色 避光 致癌 邻苯二胺 OPD 橙黄色 + + 四甲基 TMB 蓝色 - - 联苯胺 常用酶及其底物 碱性磷酸酶(AP) 常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP），产物为黄色 葡萄糖氧化酶 β- 半乳糖苷酶 （3）酶标记Ab或Ag 基本要求： 酶标记Ag：纯度要高，抗原性完整； 酶标记Ab：特异性好，效价高，亲和力 强，比活性高以及易于批量生 产和分离纯化 2.ELISA的基本原理 固相Ag/Ab的形成（包被） Ag-Ab反应 酶促显色反应 3.ELISA的类型 直接法(direct?ELISA) 间接法(indirect ELISA) 夹心法(sandwich ELISA) 竞争法(competitive ELISA) 捕获法(capture ELISA) 生物素-亲和素系统ELISA法(BAS-ELISA) 直接法可测抗原或抗体 间接法检测Ab最常用方法 间接法 夹心法——双抗体夹心法 用于检测各种大分子抗原（二价以上） 不可检测小分子半抗原 两种抗体分别针对同一抗原分子上两种表位（也可针对一种） 夹心法——双抗原夹心法 用于检测抗体 竞争法 常用于检测小分子抗原或半