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PCR原理及各类PCR仪PCR原理PCR全称是Polymerase Chain Reaction，即聚合酶链式反应，是一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，PCR的最大特点，是能将微量的DNA通过复制大幅增加。PCR技术发展历程普通PCR（梯度）荧光定量PCR数字PCR普通PCR（梯度）简单进行DNA复制扩增，然后可用电泳或者紫外分光光度计进行扩增产物的检测。目的：大量获得复制的DNA产物普通PCR仪（梯度PCR仪）其实就是一台温控仪！关键部件是温控模块！PCR反应图解和要素要素1、模板DNA2、dNTP3、Taq酶4、引物5、精确的变化的温度衡量普通PCR仪的参数（以thermo的Arktik为例）样品模块规格：96×0.2ml、384×0.03ml、双48孔×0.2ml温度梯度范围：1-30℃升降温速率：3℃/s温度均一性：±0.4℃（95℃时）温度精确性度： ±0.3℃温控范围：4-99.9℃热盖温控范围：30-110℃可调用户界面：反应曲线图显示尺寸重量电压数据交换（USB接口）保质期PCR仪三种控温方法的区别（calculated、block、probe）以bio-rad的 PCT-200型PCR仪为例：A） 计算控制（ calculated ）计算控制在运行大多数程序中是最好的温度控制方法，具有较好的温度一致性、可靠性。用计算控制时，仪器通过对样品的管子或玻片热传导的速度和样品体积进行模块温度估算（当运行程序时，这些样品信息都会显示）。因为这种估算是根据已知容量和热力学的规律，所以温度比模块或探针控制更加精确。运行计算控制能缩短实验时间，简短的程序操作能保护酶的活性并减少引物的损失。B） 模块控制（ block ）模块控制与计算控制精度相比较低。在模块控制下，样品温度通常是在模块后才到达设置的温度。这段延迟时间主要是因为管子的类型和样品体积引起的。C） 探针控制（ probe ）通常，探针控制可用于不同的环境中，但是它需要小心使用。探针不能用于微型板和玻片。市场上主要的品牌和产品AB：2720、9700、ProFlex、VeritiBio-Rad：MJ Mini、MyCycler、PTC200、PTC240、C1000、S1000Eppendorf：Mastercycler pro S/pro/pro 384荧光定量PCR荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，PCR反应过程中，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。目的：获得初始模板DNA的浓度。荧光定量PCR仪的关键是温控和荧光激发、检测系统！如何定量？Ct值的概念Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。定量原理确定初始模板的浓度初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量ACGATGCCGTTGATCTGAGGAGTGAACCACTCACTC荧光定量PCR两种1、染料法SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光2、探针法衡量荧光定量PCR仪的参数（招标）（以AB 7500为例）1 工作条件：220V电压，10A电源。相对湿度80%。热功率2600W?2 技术规格2.1 热循环系统2.1.1 加热冷却方式: 半导体2.1.2 升降温速率: 3.5℃/秒以上*2.1.3 温度范围: 4℃-99.9℃*2.1.4 控温精确度:±0.25℃2.2 样品系统2.2.1 样品通量: 单管、8联管、96孔板，并无需适配器2.2.2 反应体积: 10-100ul2.2.3 运行时间: 2小时2.2.4 机械设计: 样品无需移动2.2.5 反应后保存: 可降温至4℃保存2.3 荧光系统2.3.1 荧光染料：FAMTM/SYBR Green I, VIC /JOETM, NEDTM/TAMRATM/Cy3, ROXTM/Texas Red, Cy52.3.2 荧光校正：软件支持Rox荧光校正去除误差2.4 光学系统2.4.1 激发光源：卤钨灯，配备时间监测及自我诊断程序2.4.2 滤光系统：五色光源滤光片结合荧光滤光片（630nm-650nm，570nm-590nm，540nm-550nm，510nm-530nm，455nm-485nm）2.4.3 检测系统：CCD摄像机一次成像2.4.4 检测方式：实时动态检测，动态显示，可同时检测5种荧光染料，必须有520nm，550nm，580nm，610nm，650nm这五块滤光片*2.4.5 实验要求：必须能同时检测FAM、VIC、TAMRA、ROX四种荧光，能进行探针法定量，开展