编号生物农药研究中心[2006-1-25],共3页.docVIP

编号： 生物农药字 [2006-7-20], 共 3 页 承担单位：福建省农科院生物技术中心 课题编号： 课题名称：有机磷农药微生物降解剂“降磷灵”的研制 课题负责；刘波 林抗美 马丽娜 试验项目:不连续SDS法测定蛋白酶的纯度及分子量 试验人员：官雪芳 葛慈斌 朱育菁 试验负责: 刘波 报告日期：2006年 7月 20日 计数月份：2006 7（月份） 实验编码；设计-060321-阴沟肠杆菌中的有机磷降解酶的分离、纯化、鉴定及降解酶特性的研究-官雪芳 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农科院生物技术研究所 生物农药研究中心 电话: 传真: 前言 随着农业的不断发展，农药品种越来越多，用量也不断增加，大量农药的使用使得土壤、水源、大气甚至农产品都受到严重的污染，严重影响了人类的生存发展。而有机磷农药一直是我国用量最大的农药种类，每年都在十几万吨以上，给人类带来了很大的污染问题。微生物则是降解环境中的这些有机磷农药的主要方式。本研究以甲胺磷，乐果等有机磷农药为降解对象，进行微生物降解农药的研究，通过从药厂排污口，自己喷药的蔬菜地中分离，筛选出了一株较高效的农药降解菌，经鉴定为阴沟肠杆菌，为了摸清其生理生化特性，及降解酶特性，需要对其有机磷降解酶进行分离、纯化及鉴定，本实验通过测定不同硫酸铵沉淀得的蛋白的纯度及各蛋白的分子量，为下一步凝胶层析及离子交换层析的进行提供条件，进而为分离、纯化乐果降解酶奠定基础。 试验方法 材料： 样品：各级不同饱和度硫酸铵沉淀得的蛋白 30%丙烯酰胺贮存液：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。置棕色瓶中，4℃保存。 1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液 10% SDS溶液 10%过硫酸铵：-20℃保存 TEMED溶液：4℃保存 1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液 1×SDS凝胶上样缓冲液：2%SDS，0.1 mol/L巯基乙醇，10%甘油，0.1%溴酚蓝，0.05mol/L Tris-HCl（pH6.8）缓冲液。 5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：每1000ml该溶液中，含15.1g Tris，94g甘氨酸和50ml 10%（W/V）SDS贮存液。 10）考马斯亮蓝R-250染色液：每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（5：4：1）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R-250，过滤除去未溶物。 11）脱色液：冰乙酸:甲醇:水=1:5:4 12）Protein Marker : 分子量范围：2/3-212kDa（纽英伦生物技术有限公司） 2.2试验方法 2.2.1准备步骤 1）将凝胶板依次用水、SDS、水、无水乙醇、水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。 2）试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。 3）灭菌枪头、eppendorf管。 2.2.2、制备凝胶 1）安装玻璃板、板条，用去离子水检查其是否漏水。 2）配制12%的分离胶（5ml）：依次将1.6ml蒸馏水，2.0ml 30%丙烯酰胺贮存液，1.3ml 1.5mol/L Tris（pH8.8）溶液，0.05ml 10% SDS溶液，0.05ml 10%过硫酸铵，0.002mlTEMED混合，立即灌胶。 3）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。小心在胶上覆盖一薄层去离子水。 4）在分离胶聚合的过程（约40分钟）中，配制5%的积层胶（5ml）：依次混合3.4ml蒸馏水，0.83ml 30%丙烯酰胺贮存液，0.63ml 1.0 mol/L Tris（pH6.8）溶液，0.05ml 10% SDS溶液，0.05ml 10%过硫酸铵，0.005 ml TEMED。 5）分离胶聚合完全后，倒去去离子水，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。 6）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。 7）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，待上样。 2.2.3 样品的制备 在蛋白溶液中加入1/2体积的上样缓冲液，混合液在沸水浴中加热5分钟，冷却后即可上样。 2.2.4 上样 用微量进样器上样，Marker加15uL,蛋白样品加25 uL。 2.2.5 电泳 装好冷凝水系统，打开电源，初始电压为80V，当染料进入分离胶（这段时间约为20min）后，将电压提高到120V，继续电泳直至染