第二代测序技术[参考].ppt

2.4 RNA 测序 根据三代测序技术实时测序的特点，可以直接对RNA 进行测序，做到了对特定组织和细胞内的表达差异的精确定位。运用Helicos 操作平台对酵母的聚腺苷酸化的转录本进行精确定量，用50 个通道中的6个通道，共产生2． 4 亿个Reads。利用Helicos 遗传分析平台可以将DNA 聚合酶换成反转录酶对RNA 直接测序，主要通过Poly( dT) 包被的表面捕获聚腺苷酸化的RNA，成功完成对酿酒酵母RNA 的直接测序，免除将RNA 转变成cDNA 的过程。同时借助PacBio 技术平台，也可完成对RNA 的直接测序，Uemura 等就利用该技术进行实时测序观察核糖体中mRNA 的翻译过程。单分子测序技术最大的优势，也是最直接的应用就是检测细胞和组织内基因表达水平，同时对基因的结构做出分析，如RNA 的剪接，是否有碱基突变或异常表达基因等。而且还能检测到微量的基因表达子或罕见的非编码RNA。PacBio RS 还可对连续的A 或者T 区域测序，因为PolyA 长度和RNA 的半衰期有关，所以对长PolyA 的研究对RNA 的代谢有重要意义。 2． 5 重复序列和poly 结构的测序 在所有人的X 染色体上都有一段CGG 三核苷酸重复序列，正常人的CGG 重复次数为5-44 次。过长的重复次数会对FRM1 基因转录或翻译出FRM1 蛋白不利，当重复次数超过200 次时，就会导致脆性X 综合征，所以检测CGG 的重复次数非常有意义。但是这个重复长度的测序用Sanger 测序和第二代测序技术都是难以完成的。美国UC Davis 医学院利用PacBio 技术环形比对测序模式，对FMR1 中的CGG 三核苷酸重复区域进行了测序，获得了超过10kb 的原始读长，覆盖了CGG 重复超过750 次的三核苷酸重复区域。 第二代高通量测序技术简介 1.四大高通量测序平台 Solexa，454 (GS-FLX)， SOLiD和Polonator 2.测序原理 合成法测序(Sequencing by Synthesis) 连接法测序(Sequencing by Ligation) 454 (GS-FLX) Roche：（2005，2007，2008） 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。 454 (GS-FLX)流程 1、文库制备：基因组DNA/cDNA片段化处理至300-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA 。 454 (GS-FLX)流程 2、Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，回收纯化； 454 (GS-FLX)流程 3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。 454 (GS-FLX)流程 4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息 Solexa-Illumina Genome Analyzer 核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止” 。 原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。 SOLiD ABI(Applied Biosystems)：SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection) 原理 ：用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。 SOLiD流程 1、SOLiD基因组文库的构建 SOLiD流程 2、油包水PCR SOLiD流程 3、含DNA模板P1磁珠的固定 SOLiD流程 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程 SOLiD流程 4、SOLiD双碱基编码原理及测序流程 SOLiD流程 5. 数据分析原理 Polonator 测序原理：  Polonator系统高质量测序是一种以