第十七章动物细胞培养制药工艺.ppt

思考题 思考题 17.4. 2 动物细胞培养基本过程 原代细胞分离与培养 传代细胞培养 细胞系的保存与复苏 动物细胞培养 动物细胞培养技术 1、原代细胞分离与培养 动物组织或器官 洗涤 粉碎 酶解消化 离心或过滤 培养液稀释细胞 洗涤 接种培养 从体内取出组织或器官 经过粉碎、消化而获得单细胞 进行体外接种培养。 37℃消化，胰蛋白酶，胶原酶 消化液浓度：0.1-0.3 mg/ml 动物细胞培养 动物细胞培养技术 动物细胞培养 动物细胞培养技术 动物细胞培养 动物细胞培养技术 动物细胞培养 动物细胞培养技术 动物细胞培养 动物细胞培养技术 动物细胞培养 动物细胞培养技术 动物细胞培养 动物细胞培养技术 2、传代培养--过程 概念：对长满表面的细胞进行消化分离，接种到新的培养基上，进行新一轮培养。 传代时期：刚刚全部汇合的细胞。过早产量低，过晚健康状态不佳。 消化方法：过程与原代细胞相同。用30－50倍体积的0.25％胰蛋白酶和EDTA对细胞块消化，消化后再培养。 要注意消化程度，细胞对酶的反应不同，有的敏感，掌握好适宜的消化时间和方法，不要过度，获得细胞浓度均匀，生长速度一致的传代细胞。 防止细胞系之间、非细胞生物的污染。 动物细胞培养 动物细胞培养技术 3、细胞系的建立 动物细胞培养 动物细胞培养技术 一旦获得了稳定的有一定特性的细胞系，就建立细胞库，进行长期保存。根据药品生产的有关规定，必须建立原始细胞库和生产用细胞库或工作细胞库。 WCB1 QC WCB2 QC QC 原始培养物 MCB QC内容：细胞活性检测、无菌实验、核型、DNA分析、同工酶分析、支原体试验、其他外源物试验、稳定性和基因型分析等，工作细胞库必须与主细胞库完全一致。 4、细胞系的冻存与复苏 动物细胞培养 动物细胞培养技术 概念：细胞混悬于冻存液中，以一定的速度将细胞悬液降至-70℃以下，常于液氮下保存。 冷冻保护液： 含10％血清的培养液，附加10％甘油或10% DMSO，降低冰点，减少细胞内外冰晶的形成，减少在冻存过程中对细胞的损伤。 方法： 选用指数期细胞； 贴壁细胞须消化，制备成单细胞悬液，离心，制成106/ml； 分装至保存管中，注明细胞名称和日期； 降温：冷冻速度-1 ℃/min，当温度降至-25 ℃时，可加速冷冻。 4、细胞系的冻存与复苏 概念：以一定的复温速度将冻存细胞恢复至常温。 方法： 取出冻存管，立即放置于37～40 ℃水浴中，快速融化，应在1min内完成； 在保护剂存在下，慢冻快融是保存复苏细胞的要领。 必须要带护目镜和手套。 动物细胞培养 动物细胞培养技术 17.4. 3 动物细胞大规模培养方法 单层贴壁培养 悬浮培养 微囊培养 微载体培养 动物细胞培养 动物细胞培养技术 1、单层贴壁培养 概念：细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层细胞的培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。 生长过程： 接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面； 进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。 数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。 动物细胞培养 动物细胞培养技术 单层贴壁培养—特点 培养容器：转瓶、玻璃珠、微载体和中空纤维等。滚瓶是为早期培养所采用，结构简单，投资少，重复性好。 优点： 容易更换培养液，灌注培养时，能达到高细胞密度； 有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。 缺点： 操作较繁杂劳动强度大 检测受到限制 培养条件难以均一 传质和传氧差 占用空间大，产量低，放大培养是瓶颈。 动物细胞培养 动物细胞培养技术 2、悬浮培养 概念：细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培 养过程。 优点： 操作简单，培养条件相对均一 传质和传氧较好，容易放大培养。 缺点： 细胞体积小 密度低 培养病毒易失去标记而降低免疫能力。 适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤。 借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。 培养容器：通气式搅拌和气升式生物反应器 动物细胞培养 动物细胞培养技术 3、微囊培养 微囊培养：在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊, 再将微囊放入培养系统内进行悬浮培养。适用于贴壁和非贴壁培养。 动物细胞培养 动物细胞培养技术 1. 4 %海藻酸钠溶液 多聚赖氨酸 搅拌式或气升式反应器系统 3、微囊培养 微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。 培养结束后，收获微囊，破微囊，纯化抗体，纯化工艺简单，应用前景广。 多聚赖氨酸/海藻酸固定细胞：凝胶载体的表面被多聚赖氨酸覆盖，形成一层多孔可透薄膜，再使凝胶载体液化，便可制成微囊产品的纯度高。