SDSPAE凝胶电泳2.ppt

同济大学 周智敏 SDS凝胶电泳 实验原理 实验步骤 注意事项 SDS的优点 SDS的缺点 实验常见问题及处理 小技巧 实验步骤 １．试剂配制 　(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中。 4℃，1～2月（2）10%SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)： 称取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L盐酸调pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。 （4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8): 称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml （６）TEMED（四甲基乙二胺） （７）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml （８）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀 （９）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用 （1０）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml （1１）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml ２.　聚胶前准备 　 (1) 配制10％过硫酸铵溶液(需每天新鲜配制)。 　(2) 将单体储存液、缓冲液、水按照一定比例配制成凝胶溶液。 　(3) 将灌胶装置准备好。 　(4) 待凝胶溶液平衡至室温(23~25℃)后，真空脱气15 min。 ３．不连续系统下层分离胶的聚合 在10 ml凝胶溶液中加入10％过硫酸铵50 μl (最终浓度为0.05％)，TEMED原液5μl (最终浓度为0.05％)。轻缓地摇动溶液(8~10下)，使激活剂混合均匀。 将凝胶溶液平稳地注入两层玻璃板中(注意要以连续平稳的液流从中间位置注入)，再在液面上小心注入一层水或正丁醇(约2~3mm高)，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置至少90 min。 ４．不连续系统中的上层浓缩胶 和连续系统凝胶的聚合 　　 连续系统只含一种凝胶，它和不连续系统中的浓缩胶具有相同之处，即在其液面处与空气相接触，因此激活剂的含量应相应地增加，在10m1凝胶溶液中加入10％过硫酸铵50 μl (最终浓度0.05％)，TEMED原液10 μl (最终浓度0.1％)。 　　 同前将激活剂混合均匀，但摇动溶液时不要摇得过于剧烈以免引入过多的氧气。 吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡。 静置90 min以上以保证完全聚合。 如果在聚胶过程中发现一道道纹线，即凝胶不均匀，可能是聚合速度太快或激活剂未充分混合导致局部浓度过高。 凝胶聚合的速度可以通过紫外吸收检测，由于丙烯酰胺中的双键在260nm有吸收，聚合后双键消失，光吸收减低。将凝胶溶液倒入石英比色杯中，可观察到20~30 min后光吸收读数开始下降，至80 min以后趋于稳定，说明聚合完成。 ５．电泳 将聚合好的凝胶板安置于电泳槽中，上样，选择适当的电压进行电泳。 ６．染色和脱色 　　 电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣，此外根据不同的研究目的，也可将凝胶直接进行放射自显影及电印迹。 ７.结果处理 测量并计算分子量 蛋白质的分子量与它的电泳迁移有一定关系式，经37种蛋白的测定得到以下的关系式 Mw ＝ K(10－bm) (1) lgMw = lgK－bm = K1－bm (2) 其中MW是蛋白质分子量；K和K1为常数 b为斜率，m是电泳迁移率，实际使用的是相对迁移率mR。 mR=dpr/dBPB 实验注意事项 1. 形成凝胶的试剂要有足够的纯度：丙烯酰胺是形成凝胶溶液中的最主要成份，其纯度的好坏