二代测序在产前无创检测中的应用.pptxVIP

二代测序（ Illumina ）及其在无创产前检测中的应用213目录页CONTENTS PAGE 二代测序的基本原理二代测序的测序流程在无创产检中的应用1二代测序的基本原理Illumina 测序的技术原理是采用可逆性末端边合成边测序反应，首先在DNA片段两端加上序列已知的通用接头构建文库，文库加载到测序芯片Flowcell上，文库两端的已知序列与Flowcell基底上的Oligo序列互补，每条文库片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇，测序时采用边合成边测序反应，根据四种不同的荧光信号确认碱基种类，经过多个循环后，完整读取核酸序列。2测序流程文库制备1文库制备流程1自动簇生成2杂交到flow cell 表面Flow cell 表面结合一层oligo接头。单分子DNA片段杂交在flow cell表面后，oligo引物就会在聚合酶作用下延伸。双链分子变性分开,模板链被洗掉。新合成链以共价键的形式紧紧连接在flow cell表面。在flow cell上形成共价结合的单链DNA片段。 Each piece has a unique sequence单链弯曲杂交在相邻的oligo引物上形成一个桥式结构。杂交引物在聚合酶作用下延伸。双链的桥式结构变性打开，形成2个copy的以共价键结合在flow cell 的单链模板。单链弯曲杂交在相邻的oligo引物上形成一个桥式结构。杂交oligo引物在聚合酶作用下延伸。桥式扩增一直循环重复，直至形成5000-10000 copies双链DNA桥变性分开。Reverse strands被剪切然后洗掉。仅仅留下由forward strands组成的簇 。测序3测序引物被杂交到接头序列上。3在无创产检中的应用原理无创产前检测是通过采集孕妇外周血，提取游离DNA，采用新一代高通量技术，结合生物信息分析，得出胎儿患染色体非整倍体（21-三体又称唐氏综合征，18-三体，13-三体）的方法。该方法最佳检测时间为孕早、中期，具有无创取样、无流产风险、高灵敏度，准确性高的特点。胎儿DNA来源和特点来源：1 胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中，被母体免疫系统破坏，胎儿DNA残留下来；2 胎儿细胞凋亡；3 胎盘滋养层细胞的凋亡基本特点：1 含量有一定的变化规律。妊娠第4周开始可检出胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，存在个体差异，平均浓度。2 分娩后短时间内消失，平均半衰期为16.3min (4-30min)， 2h就无法检出。再次妊娠不影响检测结果。3 DNA片段较小，平均166bp左右。常规技术很难检测无创产前基因检测：母血浆DNA+高通量测序二代测序Unique reads (单一序列读取）: no mismatch, one location