第四章高效液相色谱..docxVIP

高效液相色谱法液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统由两相——固定相和流动相组成。固定相可是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂一层液膜）、离子交换树脂或多孔凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相（或洗脱液）推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小差异进行分离。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合色谱、离子交换色谱及尺寸排阻色谱等。为了更好地了解HPLC优越性，从两方面进行比较:HPLC比经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于气体和沸点较低化合物，占有机物总数20％。对于占有机物总数近80％的高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，主要采用HPLC进行分离和分析（只要试样能制成溶液，不需要气化，因此不受试样挥发性的限制） （2）液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。在液相色谱中，流动相液体与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上液体作流动相，增大分离选择性。②液相色谱固定相类型多，分析时选择余地大。③ 液相色谱通常在室温下操作。较低的温度，有利于色谱分离条件选择。高效液相色谱仪分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。工作过程：高压泵将贮液瓶中流动相溶剂送入色谱柱。当注入欲分离样品时，流经进样器的流动相将样品带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出信号记录下来，得到液相色谱图。高效液相色谱仪主要部件（1）高压输液系统高效液相色谱固定相颗粒极细，对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备高压输液系统。高压输液泵应符合:密封性好，输出流量恒定，压力平稳,可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。（2）进样系统高效液相色谱柱比气相色谱柱短（约5～30 cm），柱外展宽（柱外效应）较突出进样装置: 流路中为高压工作状态，使用耐高压六通阀进样装置（3）分离系统—色谱柱色谱柱是液相色谱心脏，包括柱管与固定相。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱填充物和分离柱完全一样，使淋洗溶剂经过前置柱为其中固定相饱和，在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱性能不受影响。（4）检测系统连续检测经色谱柱分离后流出物组成和含量变化。目前最常用检测器：紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 示差折光检测器 (5) 附属系统包括脱气、梯度洗脱、恒温、自动进样、馏分收集、数据处理等。梯度洗脱装置是高压液相色谱仪中重要附属装置。梯度洗脱：分离过程中使两种或两种以上不同极性溶剂按一定程序连续改变它们之间比例，使流动相极性、pH值或离子强度相应变化，提高分离效果，缩短分析时间。梯度洗脱实质：不断变化流动相极性、pH值或离子强度，调整混合样品中各组分分配比(容量因子) k ，使样品组分在最佳容量因子值范围流出柱子.液相色谱中作用相当于气相色谱中程序升温。不同的是，梯度洗脱中样品组分k值变化是通过改变流动相极性、pH和离子强度实现，不是通过改变温度来达到（气相色谱）。在线脱气装置用于脱去流动相中溶解气体，流动相经脱气装置后再输送到色谱柱。影响流动相分离的因素：流动相流速，性质和极性高效液相色谱固定相和流动相（－）固定相 以承受高压能力分类，分为刚性固体和凝胶两类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0×108～1.0×109Pa高压，制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。凝胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱，由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108 Pa。（二）流动相及流动相极性（1）显著改变组分分离状况的流动相选择非常重要。又称淋洗液、洗脱剂。（2）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相极性小于固定相极性，为正相分配色谱。适于极性化合物分离。流出顺序为：极性小先流出，极性大后流出。（3）若流动相极性大于固定相极性，为反相分配色谱。极性大先流出，极性小后流出。对流动相要求HPLC中流动相是液体，对组分有亲和力，参与固定相对组分竞争。 对流动相溶剂要求： （1）溶剂对于待分离样品，必须具有合适极性和良好选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。 （3）纯度高。（4）化学稳定性好。（5）低粘度。对于紫外吸收检测器，不能用对紫外光有吸收的溶剂。对于示差折光检测器，要求选择与组分折射率有较大差别溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。HPLC主要分离类型：1. 吸附色谱（液-固吸附色谱）：以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等。流动相是不