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临八1307班 贺雨晨 2204130717 Western Blot 蛋白质双向电泳 DNA测序 CONTENTS Western 印迹杂交技术： Western Blot 原理 步骤 应用 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 底物显色 方便、便宜、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学显色法 灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短 同位素法 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测 化学发光法 Krypton ?荧光底物 荧光底物法 显色的方法 玩转大学PPT素材 更多好素材请访问 1、Western blot法诊断囊虫病 2、荧光定量PCR 和Western- blot 检测RNA干扰肺腺癌A549 细胞STAT3基因表达水平 3、Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原 4、其他方面 1、Western blot法诊断囊虫病 囊虫病是由猪带绦虫幼虫即囊尾蚴寄生于人体引起的人兽共患寄生虫病。 免疫学试验对本病诊断有重要作用，但目前用各种方法纯化的抗原其敏感性、特异性均不理想。 运用DN A重组技术,构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库,以囊虫病患者血清及病猪血清为抗体,从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）,这些抗原克隆经IPTG诱导,形成β-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白( fusion protein, FP)。 采用简化Western blot法,以等比混和的四种融合蛋白为抗原检测囊虫病、华支睾吸虫病、包虫病患者血清中的相应抗体 2、应用荧光定量PCR 和Western- blot 检测RNA干扰肺腺癌A549 细胞STAT3基因表达水平  Western印迹分析检测STAT3表达 荧光定量PCR 检测STAT3mRNA 的表达  3、Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原 风疹病毒(ＲＶ) 能够引起先天感染。通过孕妇传播,致使胎儿先天畸形或导致先天性风疹综合征如先天性心脏病、智力低下等。 现可采用Western-blot的方法,测定风疹病毒的主要抗原性蛋白, 以指导临床应用 。 蛋白质双向电泳 Pro双向电泳 原理 步骤 应用 蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing,IEF）,根据蛋白质的等电点不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），按亚基分子量大小进行分离。经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。 样品的制备 ↓ 等电聚焦 ↓ 蛋白质检测 ↓ 图像分析 1、人类疾病的蛋白质组研究 2、致病微生物的蛋白质组研究 3、新抗生素作用机制的研究 1、人类疾病的蛋白质组研究 a）直肠癌 直肠癌的发生是一个多基因突变导致抑癌基因失活、癌基因活化的过程。研究发现在相对分子质量为13000和等电点（PI）值为5.6处的蛋白质仅出现在结肠癌的组织中。 b）肝癌 用N.甲基.N.亚硝基脲诱导的小鼠肝癌中，用2.DE及氨基酸微型测序可分辩出肝癌诱导的醛糖还原酶样的蛋白质，此种蛋白质在肝癌、胎肝中有高表达。 2、致病微生物的蛋白质组研究 弓形体抗原的检测 ： 弓形体病是由鼠弓形体虫引起的寄生虫病，如果怀孕的妇女在妊娠期受到感染，该虫可通过胎盘引起胎儿感染。由于弓形体病婴儿出生时可无明显症状，因此临床上能否做到早期诊断，而使患者得到早期治疗尤为重要。 将鼠弓形体虫RH株在人羊膜细胞系FL521中表达后，用2.DE得到300个银染斑点，再将其与以下3种患者的血浆进行免疫杂交:（结果有9个斑点对各阶段的弓形体感染均反应，这9种斑点被用来当作弓形体感染的标记，其中7种标记可用作区别疾病的不同阶段。 3、新抗生素作用机制的研究 新抗生素作用机制的研究方面，2.DE技术发挥了重要作用。因现在细菌对大多数抗生素都有了抗药性，而用于临床的抗生素几乎都是原有抗生素的衍生物，目前这种状态有所改变。 在研究抑制核糖体类抗生素对细菌的作用机制时，对12种作用于翻译过程不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察，发现了其中8种诱导冷休克反应的一系列蛋白质及另4种诱导一系列热休克反应的蛋白质，因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这两种反应，并且藉此可推测大肠杆菌对冷热休克的反应发生于核糖体水平上 。从而也许可以从