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杭州市科技发展计划 B35细菌性食物中毒病原的分子快速鉴定和筛检技术的研究 课题组成员： 潘劲草 于新芬 孟冬梅 张 蔚 汪皓秋 叶 榕 斯国静 承担单位： 杭州市疾病预防控制中心2006年12月 目 录 摘要-----------------------------------------------------------------------------------1 本研究细菌性食物中毒标本多重实时PCR检测流程图-------------------3 研究报告一： 多重实时PCR检测致泻性大肠埃希菌志贺毒素和紧密素基因------------------------4 研究报告二： 多重实时PCR检测沙门菌invA、肠产毒素性大肠埃希菌elt、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌ipaH毒力基因----------------------------------------------------------------------14 实时PCR检测肠毒性大肠菌耐热肠毒素多重实时PCR检测金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌摘 要 细菌性食物中毒的控制要求具有快速、准确的检测技术。在实验室检验技术方面，以下几点会可能影响细菌性食物中毒判明率提高：1）有些能引起食物中毒的细菌并未列入常规检查，如肠炎耶尔森菌、单增李斯特菌、空肠弯曲菌等。2）有些致病菌需特定的方法才能鉴定，如肠产毒性大肠杆菌的肠毒素检测等。3）如果需检验的标本量大、项目多，可能造成检验人员精力分散，漏检致病菌。 近年发展起来的实时PCR技术具有敏感、特异、快速、简便及PCR产物污染可能性低的优点，特别是多重实时PCR则更能提高检测效率；该技术应用于细菌性食物中毒病原的菌株鉴定和标本直接快速筛检，有助于提高细菌性食物中毒的判明率。 本研究针对不同来源的食物中毒标本，应用简便的DNA提取步骤，根据多重PCR原理，设计互不干扰的多种致病菌特异引物及不同类型荧光素标记的特异性探针，建立了5套不同组合的多重实时PCR技术： 检测产志贺毒素大肠埃希菌和肠致病性大肠埃希菌stx1、stx2和eae基因； 检测沙门菌invA基因、肠产毒素性大肠埃希菌elt基因、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌ipaH基因； 检测副溶血弧菌gyrB基因、tdh基因和霍乱弧菌ctxA基因； 检测单增李斯特菌hly基因、空肠弯曲菌hipO基因、小肠结肠炎耶尔森菌ail基因； 蜡样芽孢杆菌16S rDNA、ces基因、金黄色葡萄球菌nuc基因。 另外还建立了分别检测副溶血弧菌trh1和trh2基因和肠产毒素性大肠埃希菌est1a和est1b基因的单重实时PCR技术，作为多重实时PCR技术的补充。 应用上述建立的多重实时PCR技术检测沙门菌、志贺菌、产志贺毒素大肠埃希菌、肠产毒素性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等菌株的特异性基因，与菌株鉴定结果和普通PCR结果比较，阳性和阴性符合率均为100%。 应用多重实时PCR技术还直接用于散发腹泻患者肛拭子标本的检测，直接扩增出肠产毒素性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、副溶血弧菌等特异性基因；与常规细菌培养结果比较，多重实时PCR技术在检测致泻性大肠埃希菌时具更高的检测效能，检测副溶血弧菌则检出率类似但检测速度更快。直接进行多重实时PCR检测的优点是：能对大量标本同时进行多种致病菌的筛检，且在PCR反应过程可实时获取阳性菌的信息，减少下一步电泳鉴定的工作量，并根据结果提示，针对性地对筛检阳性标本进行特定致病菌的常规分离鉴定，从而达到快速高效的目的。 小结：本研究建立了细菌性食物中毒常见病原菌的多重实时PCR技术可应用于细菌性食物中毒标本的快速筛检和菌株的快速鉴定细菌性食物中毒标本多重实时PCR(MRP)检测流程图研究报告一 多重实时PCR检测致泻性大肠埃希菌志贺毒素和紧密素基因 【摘要】 目的 建立多重Real-time PCR方法检测大肠埃希菌志贺样毒素(stx1、stx2)基因和紧密素基因(eae)。方法 设计引物和探针，优化多重Real-time PCR的反应条件，检测系列稀释的阳性菌DNA提取物及纯化阳性质粒。多重Real-time PCR方法检测42株携带已知毒力基因的大肠埃希菌，比较其阳性和阴性符合率。对比3种粪便样品处理和DNA提取方法，选出最适方法；多重Real-time PCR方法对36份腹泻病人粪便标本进行直接检测，并对阳性标本进行了菌株的分离和鉴定。结果 该方法最低可以检测到101拷贝/μl的毒力基因、102 CFU/μl的DEL933大肠埃希菌。检测42株携带已知毒力基因的大肠