标记物的制备与鉴定答题.pptVIP

标记物制备与鉴定 125I- 125I或125I+ 125I-标记物 （混合物） Ch-T、LPO氧化 取代反应 直接标记法 化学或酶促反应，将 放射性负电碘离子氧 化成碘原子或正电碘 离子，通过取代反应 置换被标记物分子中 酪氨酸或酪胺残基以 及组胺残基上的氢原 子。 使用无还原剂的高比放射性碘源 被标记物用量要少 ch-T用量要低 控制总反应体积200μl 反应时间1-2分钟 弱碱性反应条件 bolton-Hunter 间接标记法 联接标记( bolton-Hunter )预先将125I 用ch-T法标记琥珀酰 胺酯，制成的125I 化 脂功能基团可与蛋白 分子上的氨基酸残基 反应，从而使待标记 物被碘化。 聚合、损伤物 标记蛋白 游离125I 125碘-标记物的制备－纯化 凝胶过滤法 离子交换层析法 聚丙烯酰胺 凝胶电泳 高效液相色谱法 125碘-标记物的制备－鉴定 放射化学纯度 单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率 应大于95% 免疫活性 标记物与抗体结合的能力 标记物与过量抗体反应百分比 该值越大, 标记物免疫活性好 结果准，测定复杂 比放射活性 单位化学量标记物中含的放射性强度 单位：Ci/g mCi/mgCi/mmol 比放射性过高，将影响标记物免疫活性 计算法：依据标记反应中放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射性. 自身置换法 ：比较标记抗原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性 结果欠准，计算简便 比放射性－计算法 自身置换曲线 反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原 标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少 两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性 标准曲线 反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成 标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少 比放射性=自身置换法 比放射性－自身置换法 标准曲线与自身置换曲线平行 表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合的抗原物质总量相同 计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm/ml换算为nCi/ml) 计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量(ng/ml) 以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直线回归，其斜率即为比放射(nCi/ng）