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β-防御素 自然界存在着无数的微生物,它们时时刻刻都在威胁着其他物种的生命。多细胞生物为了抵御各种有害微生物的入侵,逐渐进化发展并形成一套完整有效的免疫防御机制。其中一种就是近年来已引起广泛研究兴趣的阳离子抗菌肽———防御素。1991年首次在牛体内发现β-防御素-2这一阳离子多肽抗生素,命名为TAP ( TrachealAntmi icrobialPep-tide),后来在牛的粒性白细胞中又发现了13种与TAP序列高度同源,但与α-防御素不同的防御素,于是命名为β-防御素[1],之后的10多年,有多种β-防御素被分离和鉴定,已阐明β-防御素具有多种抗菌、抗真菌、抗病毒活性,并且带电荷氨基酸和特殊氨基酸的改变会导致抗菌谱的变化[2]。β-防御素主要分布于呼吸道、胃肠道、生殖道表面和腺体中,形成抵抗病原体的第一道重要防线。 1　β-防御素的分子结构 成熟的β-防御素一般由38~42个氨基酸组成,前体分子由64~68个氨基酸残基组成,信号序列和前导序列是22~32个氨基酸残基。在整个氨基酸序列中只有2种氨基酸残基(共8个氨基酸)被高度保存,第一种是位于N末端的甘氨酸(2个)。第二种是半胱氨酸(6个),保守的6个半胱氨酸残基形成3个二硫键稳定结构,连接方式为Cys-2与Cys-4,Cys-1与Cys-5和Cys-3与Cys-6相配对连接[3-4],形成了3股反向平行的β-片层结构。二硫键和β-片层结构可以使小分子防御素紧密联结以防御蛋白酶水解,所以在富含蛋白的吞噬溶酶体环境中仍能保持其特性。这也是防御素区别于其他抗微生物肽的主要因素[5-6]。 2　β-防御素的生物学活性 抗菌活性　每种β-防御素在体内都表现广谱的抗细菌或真菌的能力。体外试验表明,HBD-2对大肠杆菌的LD50为0.46 nmol/m;lHBD-2杀绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC62 g/m,l而杀大肠杆菌的MIC15 g/ml[7-8]。禽β-防御素中Sphe-2的抗菌谱不仅包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,还对烟曲霉菌有抵抗作用,进一步研究表明合成的Sphe-2在低pH值条件下仍具有抗菌活性,这对企鹅在孵蛋期保存其 胃内食物具有重要意义[9]。大多数研究表明,β-防御素在较高的抗菌活性阳离子浓度(如氯化钠)下将丧失抗菌活性。抗菌活性的丧失主要取决于电荷离子。一项关于HBD-2的研究表明,二价的阳离子(如Ca2+、Mg2+)相对于一价阳离子(Na+、K+)具有较高的 抑制其抗菌活性的能力[2,5,10]。 2.2　抗病毒活性　人β-防御素(1-3)已被证实对病毒具有杀伤作用,这些防御素对单疱疹病毒、流感病毒、艾滋病病毒(HIV)等衣壳病毒有明显的杀伤力。体内试验显示,β-防御素可延缓或根除兔梅毒,可使牙周炎龈下菌群恢复正常。已证明β-防御素对病毒的杀灭作用依赖于其分子内二硫键的紧密程度、β-防御素的浓度等因素,还与pH值、温度等因素有关[11]。 2.3　细胞毒作用　在体外试验研究中,观察纯化的β-防御素对人及小鼠数种肿瘤细胞的作用情况,发现β-防御素对白血病细胞系、淋巴瘤细胞系及实体瘤细胞具有毒性作用,并且这种抗肿瘤功效与其作用时间和剂量呈正相关。需要指出的是,β-防御素的细胞毒活性是非肿瘤细胞特异的,它不仅对肿瘤细胞具有毒性作用,而且对自身细胞也有一定侵害作用[12]。但是进一步研究表明β-防御素对宿主细胞的毒性是由于β-防御素较高的正电荷和高度的疏水性导致的,但是具有较高的正电荷和低度的疏水性的β-防御素只有抗菌作用却不表现细胞毒作用[13]。 2.4　其他生物学活性　β-防御素不仅作为抵御微生物入侵的首道屏障发挥重要作用,而且也是机体免疫反应的重要组成部分。如β-防御素(1-3)有多种免疫活性,可以诱导Mast细胞释放组胺,是单核细胞、树突状细胞、多形核中性粒细胞和T细胞的化学诱导剂,并且可以促进TNF和IL-1的产生[8]。也有研究表明β-防御素能够激活人的补体系统[11]。其中β-防御素-3能够通过下调截短性BId(一种促凋亡蛋白)、上调BcL-xL(一种抗凋亡蛋白),作用于细胞表面的CCR6,抑制中性粒细胞的凋亡[14]。此外,研究表明β-防御素-2还可以显著地趋化未成熟的树突状细胞和T细胞以及7种不同基因编码的相关蛋白,进而直接或间接地参与到先天性免疫中来[15]。 β-防御素还可以通过调节细胞因子降低机体的炎症反应。近期研究发现,HBD-3与rHagB(红血球凝集素B)结合后,可以显著减轻IL-6、IL-10、GM-CSF和TNF-a所诱导的炎症反应,同时还可以降低一半的酶活性[16]。 3　β-防御素的作用机理 3.1　抗菌机理　大多数的HBD-2和HBD-3拥有两性分子的活性,研究认为,这些两性分子有助于缩氨酸分子在细菌膜表面的堆积,进