第12章 免疫组织化学技术.pptxVIP

临床免疫学检验技术第十二章免疫组织化学技术欧启水目 录第一节 酶免疫组织化学技术 第二节 荧光免疫组织化学技术第三节 亲和组织化学技术第四节 免疫标记电镜技术第五节 免疫组织化学技术的临床应用第六节 影响免疫组织化学技术的主要因素免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：酶免疫组织化学技术荧光免疫组织化学技术免疫金（银）组织化学技术亲和组织化学技术免疫标记电镜组织化学技术免疫组织化学的基本过程包括：抗原的提取与纯化免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化将标记物与抗体结合形成标记抗体标本的处理与制备抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应观察结果第一节 酶免疫组织化学技术定义：在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。标本类型：有组织切片、组织印片和细胞涂片等。酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标记抗体酶免疫组化技术两种类型。酶标记抗体免疫组织化学染色直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。酶标记抗体免疫组织化学染色比较直接法间接法优点操作简便特异性强检测敏感性高制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体缺点敏感性低制备的抗体种类有限特异性不如直接法操作较为繁琐非标记抗体酶免疫组织化学染色酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色（图12-1）。酶桥法图12-1 酶免疫组织化学（酶桥法）原理示意图非标记抗体酶免疫组织化学染色过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法：是在酶桥法基础上加以改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物，图12-2）。该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同（图12-3）。PAP法图12-2 PAP复合物图12-3 酶免疫组织化学（PAP法）原理示意图非标记抗体酶免疫组织化学染色双桥PAP法：该法建立在PAP法的基础上。其基本原理是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP）法：用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)—抗碱性磷酸酶(AAP)法，即简称APAAP。其技术要点与PAP法相似。酶底物颜色辣根过氧化物酶（HRP）二氨基联苯胺（DAB）棕色氨基乙基卡巴唑（AEC）橘红色4-氯-1-萘酚灰蓝色碱性磷酸酶（AP）α-萘酚磷酸盐+快蓝深蓝色α-萘酚磷酸盐+快红红色溴氯羟吲哚磷酸盐（BCIP）+氮蓝四唑（NBT）紫蓝色酶免疫组织化学染色中的常用酶及显色底物：第二节 荧光免疫组织化学技术定义采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，可以分辨出抗原（或抗体）所在位置及性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以实现抗原（或抗体）定位、定性和定量测定的目的。组织处理标本类型：涂片和印片组织切片：冷冻切片；石蜡切片细胞培养标本活细胞染色标本的保存：标本在固定干燥后，最好立即进行荧光抗体染色及镜检。如必须保存时，则应保持干燥，置4℃以下保存。但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，数天后就失去其抗原性，需在-20℃以下保存。荧光抗体的标记及染色常用于荧光免疫组织化学技术的荧光素包括异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）、藻红蛋白（phycoerythrin, PE）等。荧光抗体的标记及纯化详见第四章 。根据染色方法的不同，荧光免疫组织化学技术可区分为直接法和间接法。荧光抗体染色的结果一般用“-”或“+”表示。染色及结果判读详见第八章 。第三节 亲