第六节 药物的抗病毒实验安徽医科大学_幻灯.pptVIP

4.2中性红染色法 基本步骤同上，加入药物培养3 d后待CPE不再进展时，弃维持液，用PBS洗2次，每孔加入0.2ml中性红染液（0.04%），避光，37℃、5%CO2孵育1.5 h。弃染色液，用PBS洗2次，控干，每孔加入0.2ml的90%乙醇（无水乙醇：0.2M，pH4.2枸橼酸缓冲液=9：1），室温放置2~3 h，摇匀，以空白对照孔调零，在酶标仪546nm处比色，测定其吸光度A值。根据各组的平均A值，计算药物的抑制百分率，再按Reed-Muench法计算50%抑制浓度（IC50）等各项结果。整个实验重复3次。 实验组平均A值-病毒对照组平均A值 抑制百分率 =细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值 ×100% 4.3 MTT法 基本步骤同上，当病毒对照组细胞CPE在(+ + +)～(+ + + +)时弃培养液上清，每孔加入含5g·L MTT的培养液50μl，继续培养2~3 h后弃去MTT上清，每孔加DMSO 100μl，混匀5min后，用酶标仪测570nm波长处的吸光度A值。按下述公式计算药物对病毒的抑制率： 病毒抑制率(%)=(药物处理组A均值-病毒对照组A均值)/(细胞对照组A均值-病毒对照组A均值) × 100%，结合细胞毒性实验的结果，用统计软件SPSS13.0的Probit回归法，或按Reed-Muench法，计算受试药的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50，并计算药物的治疗指数（TI）。 4.4空斑抑制法 参照上述方法进行（略），与病毒对照组比较，计算药物的50%抑制浓度IC50。 4.4药物对RSV侵入细胞的阻断作用 根据药物毒性实验的结果，从药物的最大无毒浓度开始，将不同浓度受试药100μl预先处理细胞2 h, 以PBS洗涤2次后用100 TCID50 的病毒每孔100μl攻击,吸附2 h，每隔15min摇晃 1次，使病毒均匀吸附。弃病毒液,加100μl细胞维持液，置37℃、5%CO2培养，每日观察并记录CPE。实验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药物组。当病毒对照组CPE在75%~100%时弃培养液上清，每孔加入含5g·L MTT的培养液50μl，继续培养2～3h后弃去MTT上清，每孔加100μl DMSO，混匀5min后，用酶标仪测490nm波长处的A值。按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50。 4.5药物对RSV的直接杀伤作用 根据药物毒性实验的结果，从药物的最大无毒浓度开始，将不同浓度的含药维持液与100μl的100 TCID50病毒等体积混合，37℃、5% CO2条件下作用2 h后，再将其感染Hep-2细胞，100μl/孔，吸附2 h后用PBS洗涤2次，每日观察并记录细胞病变效应（CPE）。实验设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性对照组和药物组。当病毒对照组细胞CPE在75%~100%时弃培养液上清，每孔加入含5g·L MTT的培养液50μl，继续培养2~3h后弃去MTT上清，每孔加DMSO100μl，混匀5min后，用酶标仪测490 nm波长处的A值。按Reed-Muench法计算药物的半数中毒浓度TD50和半数有效浓度EC50。 5.治疗指数（TI） 按TI= TD50/EC50 或TD50/IC50进行计算。药理学实验规定，TI﹥4表示药物有效。 三）体内抗病毒试验 1.实验动物的选择 试验动物在病毒学研究中的用途主要有：分离与鉴定病毒、制备疫苗及诊断抗原、制备免疫血清、研究病毒的致病性、免疫性、发病机理及有效药物疗法等。病毒接种于何种动物以及选择何种接种途径，主要取决于病毒的种类和实验研究的目的。应根据实验需要选择最敏感动物作为实验对象，常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接种时要根据病毒对动物及组织细胞的亲嗜性而选择特定的部位，常用接种途径有鼻腔、腹腔、脑内、皮下、肌肉、静脉及小鼠经口接种、家兔角膜注射等。给药方式亦可有腹腔、灌胃、静脉注射、肌肉注射、吸入等。 采集全血、血浆、血清、组织脏器或细胞等标本，进行相应指标的检测。为减少个体差异，一般试验选择成年动物，动物体重尽可能一致；如无特殊要求，实验动物的性别应先选雄性动物或雌雄各半，且动物要健康，雌性动物怀孕及授哺期不宜采用。此外，根据实验研究不同的精确程度要求，选择标准化试验动物。标准化试验动物是指按遗传控制方法和微生物控制标准培育而成的动物。按遗传学控制原理可分为近交系、远交系、突变系、杂交一代等，按微生物学控制原理可分为无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物、清洁动物等。病毒接种完成后，按一定级别的动物饲养标准饲养，对照组与实验组分