综合实验 化能异养微生物的分离与纯化(实验要求).docx

化能异养微生物的分离与纯化(综合)安排说明：本实验要求以实验小组为单位完成。第8周起，各小组应该下载相关资料，做好预习（器材申报与领用）。集中实验时间：11周~13周。11周：提交实验材料要求清单一式两份，一份上交，并根据清单领取器材。12周：开展实验，实验完成后整理实验结果，撰写实验报告。13周：完成整个实验器材归还。本次实验考评占实验总成绩的20%！ 考评内容包括实验纪律、操作技术、实验报告。实验结果组内共用，实验报告自己写。注意：期末实验课成绩=实验考试（卷面成绩、操作各占50%）50%+实验报告20%+综合、设计实验成绩20%+平时成绩10%）第一部分：实验原理及目的要求[目的要求]1．掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 2．学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3．学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。4．学习平板菌落计数法。 [基本原理]土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；白面曲(发面用的引子)或酒曲或果园土中分离酵母菌。为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品中各类微生物的相互干扰，通常需要使用不同的培养基，进行富集和选择培养。如细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多．但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10%酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25-50μg /mL以抑制细菌；添加制霉菌素50μg／mL或多菌灵30μg／mL以抑制霉菌)；酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快。细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前须添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。四大类微生物的分离培养基、培养温度、培养时间见表1。表1 四大类微生物的分离条件样品来源分离对象稀释度培养基名称培养温度（℃）培养时间/d土样细菌10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30~361~2土样放线菌10-3，10-4，10-5高氏1号285~7土样霉菌10-2，10-3，10-4马丁氏培养基28~303~5面曲或土样酵母菌10-4，10-5，10-5豆芽汁培养基28~302~3细菌分离平板细菌单菌落牛肉膏蛋白胨30~371~2注：本实验的目标在于两项核心实验操作技能（按美国微生物学会核心课程实验操作技能第3条）：1）无菌操作技术——包括灭菌技术及保持相关器具的无菌状态；无菌操作技术；获得微生物样本；2）梯度稀释技术估算微生物的数目——正确选择和使用移液管和移液装置；正确涂布样本以准确计数；估计所需要稀释的倍数；根据平板计数值推测出起始样本的CFU或PFU。第二部分：综合性实验——化能异养微生物的分离纯化（自主实验设计与要求）一、分离四大类微生物（细菌、放线菌、酵母、霉菌），要求每类型微生物各分离到2株菌，纯化后以斜面（8支）的形式交验；计算所采集土壤中的细菌含量（CFU，要求交验计数所用的12块平板）。二、技术达标1.培养基的配制：根据不同微生物的营养需要特点，配制相应的培养基，并进行培养基的验证。2.掌握梯度稀释法、划线法基本技术，其中划线法要求每人独立完成一份。3.对所分离的菌株其菌落特征的表述（列表）。4.小组的管理与合作。三、实验结果与汇报1.综合报告：全组撰写一份综合报告。含预方案（主要是器材计划、时间安排），执行记录，结论以及综合分析。可按需要自行设计表格，规范执行、规范记录。报告的写作，请严格按照我院报告的格式要求，并参考网络课程中“实验报告互评的评分要求”中的相关要求执行。2.个人实验报告：每人一份实验报告，重点报告实验现象、观察思考，结果分析，综合体会等，不涉及方案及实验原理、步骤等的记录。3 实验汇报，以实验小组为单位，制作PPT，交流。小组互评，推优。四、实验安排与完成时间1. 本周完成方案学习与器材申请，并填写附表1、2相关内容。（见附录）本周、下周为集中实验时间，在实验