第二章第二节分子荧光和磷光分析法.ppt

* 第二章 分子发光分析法 一、 仪器与结构流程 instrument and general process 二、 荧光分析法和应用 fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法及应用 phosphorescence analysis and application 第二节 分子荧光与磷光分析法 molecular luminescenceanalysis molecular fluorescence and phosphorescence analysis * 一、仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、激发单色器、样品池、发射单色器和检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源，主要有365、405、436nm 的三条谱线，尤以365nm谱线最强，一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源 光源要求强度大、使用波长范围宽 * 1.定量依据与方法 (1)定量依据 荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率?的乘积： If = ? Ia （1）式 根据吸收定律，I0—入射光强度， It—透射光强度，则 Ia=I0- It （2）式 由朗-比耳定律：A= lg(I0/It)=?bc It=I0·10-A=I0·10-?bc Ia = I0(1-10-? b c ) （3）式 If = ? I0(1-10-? bc ) = ? I0(1-e-2.3? b c ) （4）式 将上式展开，得： 二、荧光分析方法与应用 If = Kc 当I0一定时，得 浓度很低时（A =?bc 0.05时），得： If = 2.3 ? I0 ? b c I0 It 入射光 透过光 * 定量关系的成立条件为： εbc小于0.05 ，此时?与浓度无关，为定值； 即这种线性关系只有在极稀的溶液中才成立． 对于较浓溶液， 由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度与浓度不成线性关系。 If = 2.3 ? I0 ? b c If = Kc 问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高? ①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大倍数; ② I0↑ A= lg(I0/It) * （2）定量方法 标准曲线法： 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度； 1. 确定?ex和?em (激发光谱和发射光谱)； 2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光物质的浓度. If = Kc * 3.荧光分析法的应用 (1)无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定(液氮温度-196℃)； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定 如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法. 如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在1000℃烧成熔珠后测量. * * (2)生物与有机化合物的分析 脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反应后才能进行荧光分析。 带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸，可以直借用荧光法测定。 见表. 芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶、维生素等均可用荧光法进行分析。 * * 磷光分析法基本原理 一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的分子跃迁返回基态时所产生的辐射。 二、与荧光比较，