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實驗十一、流式細胞儀 日期：2005/12/8 預習： 流式細胞技術是一個重要的定量分析的技術，它可以依據細胞特殊標定物的數量，而不只是依據標定物的存在與否而來分別出一個細胞群體。而且它可以針對對細胞固有的性質，例如光散射的測量與定量測定細胞的特徵如表面受體、和DNA同時進行多參數相關的分析。在必要時，還可同時再測定胞漿內抗原、核內抗原等等。如此一來，就有可以從一個複雜的細胞混合體中，分別出某一個特定的細胞亞群。所以必需快速測量才能將稀有的亞群從大量的細胞分選出來。而所謂分選即是流式細胞分選的方法，它是根據所測定的各種細胞性質的不同組合，從細胞群體中將某個亞群分選出來，以對它進行功能研究、形態學研究、進一步培養或做其他的分析。 原理： 流式細胞儀包括液流系統、光學系統、分選系統和電子系統。待測樣本中的細胞經液流系統傳送依序地通過流式細胞儀中雷射照射的區域，細胞受雷射的激發產生信號，被信號接收器接受並放大，這些放大了的信號經電腦分析處理，並以圖表的形式直觀地顯示出來；通過分選系統還可以將某些類型的細胞群體篩選出來。流式細胞儀產生並分析的信號主要有光散射信號和螢光信號。光散射信號的強弱可以反映細胞的大小、形態及胞漿顆粒化的程度等。依螢光素的不同，用不同波長的光激發，發射出不同波長的螢光，可顯示不同的顏色，在不同的實驗體系中，這些螢光信號就可以反映不同的細胞生物學特性。步驟： 立即毒性 細胞以PBS清洗，刮下製成細胞懸浮液。 於流式細胞儀專用小管中加入990 μL PBS及10? μL藥物，均勻混和。 細胞加入細胞儀專用小管中，避光培養30分鐘。 加入PI 5 μL（PI之最終濃度為5 g/mL），避光培養10分鐘。 以流式細胞儀分析。 長期毒性 培養基中加入藥物，以替換原本的細胞培養基，培養1天。 細胞以PBS清洗，刮下製成細胞懸浮液。 於流式細胞儀專用小管中加入900 μL PBS及100? μL細胞懸浮液。 加入PI 5 μL（PI之最終濃度為5 g/mL），避光培養10分鐘。 以流式細胞儀分析。 結果： 圖一到圖八為Hela cell經不同濃度不同藥物處理不同時間後以以流式細胞儀分析後的結果，左圖橫軸為Side Scatter（SS）與細胞質濃度成正比，縱軸為Forward Scatter（FS）與細胞大成正比，圖上的百分比為在框起來的特定FS及SS佔全部細胞的百分比；右圖為細胞經PI染色後螢光三的強度（615nm），圖上的百分比是有染上PI的細胞佔所有細胞的百分比。討論： 所偵測到的SS或FS過大或過小都可能是雜質，所以選取一個固定的範圍可以知道總共有多少百分比的細胞。當細胞死亡後細胞膜會不完整，所以PI染劑可以進入細胞內將核酸染色，所以流式細胞儀可以偵測到螢光，也就是說染上螢光的細胞為死細胞。可以看到Hela cell經1％ DMSO處理30分鐘後，大概會有30％的細胞死亡，被染上PI螢光染劑，經10及5μM BBP處理30分鐘後細胞死亡的百分比並沒有太大的差異，但可以看到經10μM處理的細胞死亡率較5μM處理的細胞高出2％（圖三、圖四），在另一個重複實驗則是高出10％（圖五、圖六）；Hela cell經10μM BBP處理一天後其死亡率只有13.8％。由實驗可看出短期毒理BBP的濃度越高會讓細胞的死亡率越高，可是長期毒理看出BBP不會隨著時間增成而使細胞死亡率增加。心得： 流式細胞儀，可以使實驗的速度加快，排除人為的誤差，是個很好的實驗儀器。雖然說操作有點複雜，但是我想如果學會了會很受用，我聽過了三次流式細胞儀的講解，原理大致上都了解，也看過如何操作，只是到目前為止都還沒有自己使用過流式細胞儀，希望有一天我可以自己操作流式細胞儀。 附錄： 圖一.Hela cell經1％ DMSO處理30分鐘後以流式細胞儀分析之結果 圖二.Hela cell經1％ DMSO處理30分鐘後以流式細胞儀分析之結果 圖三. .Hela cell經10μM BBP處理30分鐘後以流式細胞儀分析之結果 圖四. Hela cell經5μM BBP處理30分鐘後以流式細胞儀分析之結果 圖五. Hela cell經10μM BBP處理30分鐘後以流式細胞儀分析之結果 圖六. Hela cell經5μM BBP處理30分鐘後以流式細胞儀分析之結果 圖七. Hela cell經10μM BBP處理一天後以流式細胞儀分析之結果 圖八. Hela cell經5μM BBP處理一天後以流式細胞儀分析之結果