猪肠道酵母的分离与鉴定.docxVIP

猪肠道酵母菌的分离与鉴定摘要：采用选择性培养基，从健康成年猪空肠分离到4株野生型酵母菌株，编号为:JSY1,JS Y2, JSY3, JSY4，通过形态学和生理生化特征对其进行了属的鉴定。并进一步用PCR方法扩增了这些菌株比较保守的25SrDNA片段，通过对其序列分析，构建系统树，更加准确地确定了这些菌株的遗传背景及种属关系，为转基因微生态制剂的制备奠定了良好的基础。关键词：酵母菌；分离鉴定；猪肠道；25SrDNAIsolation and Identification of Yeasts from Intestines of SwineZHou Ping ,WANG He-ping, ZHENG Qing-wei(1.Bengbu Medical College, AnhuiBengbu233030;Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018)Abstract: The four wild yeasts were isolated from jejunum of healthy and grown-up swines with selective medium,coded JSY1,JSY2,JSY3,JSY4.The preliminary generic identification was done through morphological and physiological-biochemical characteristics . Further ,relatively conservative 25s ribosomal DNA of these yeasts were amplified by PCR and the phylogenetic tree was constructed through sequence analysis of 25s ribosomal DNA. According to the phylogenetic tree ,we determinded more accurately the heredity background and affinity of these wild yeasts. The reseach provided a good foundation for making transgenic microecologics.Key words: yeast; isolation and identification; pig intestines; 25srDNA本实验从猪空肠道中分离到4株野生型酵母菌编号为:JSY1,JSY2, JSY3, JSY4，通过形态学和生理生化特征的研究初步对其进行了属的鉴定，但酵母菌属成分芜杂，数目众多，菌株的归属关系并不确定，以形态、生理生化特征区别种、属有一定的局限性。根据核苷酸序列的保守性推断菌株亲缘关系弥补了上述分类方法的不足。rDNA分布广泛且保守性强，普遍应用于生物进化分析。酵母DNA包括18S、5.8S、25S及5SrDNA，其中18SrDNA和25SrDNA保守性较好。用PCR方法扩增这些菌的25SrDNA片段，由于25SrDNA片段包括较多的保守区域及较少变异区域，大体反映了25SrDNA的总体变异程度[1]。对它们进行序列分析，更加准确地确定了这些菌株的遗传背景及种属关系，为转基因微生态制剂的制备奠定了良好的基础。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种 菌种采自健康成年猪的空肠。1.1.2培养基麦芽汁培养基，Gorodkowa培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基，糖发酵基础培养基，同化碳源基础培养基，同化乙醇基础培养基，同化氮源培养基，产生类淀粉化合物培养基，产脂培养基，脱脂乳培养基，无维生素基础培养基，高渗透压培养基，尿素分解培养基，明胶培养基 。培养基按照文献[2]、[3]配制。1.1.3主要试剂 2%美兰染色液，路哥氏碘液，纯化试剂盒（大连宝生物公司）。1.1.4主要仪器超净台（上海 Clean bench），培养箱（SP-01），灭菌锅(YSQ.SG41.280)，pH计(PHS-3B)，天平(Surtorius)，冰箱(Haier BCD-278/D)，显微镜(Panasonic WV-410)，移液器(NICHIRYO 日本)，PCR 仪5331，DYY-Ⅲ8A 稳压稳流定时电泳仪。 1.2 方法1.2.1 猪肠道的采集与保存在屠宰现场按解剖学位置，结扎完整的猪空肠，剪下，用无菌水清洗后放入无菌盒内，迅速拿回实验室放入低温-80℃冰柜中保存。 1.2.2 酵母菌的分离[4] 在无菌条件下取结扎的猪空肠小段，用消毒剪子纵向剪开，用无菌