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第四章 基因操作中大分子的分离和分析 第一节 DNA的分离、检测和纯化 第四章 基因操作中大分子的分离和分析 一、大肠杆菌质粒DNA的分离和纯化 1. 碱裂解法提取E.coli质粒DNA 2. 通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA 1. 碱裂解法提取E.coli质粒DNA 原理： 碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异： 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态； 将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。 通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋 质粒提取 （一）仪器： 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料： 含pUC18（或其他）质粒的大肠杆菌 （三）试剂： LB培养基（液体、固体） 溶液I　 溶液II　 溶液III　 TE(pH8.0) 2. 通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA 二、电泳检测 （一） DNA的琼脂糖凝胶电泳 （二）聚丙烯酰胺电泳 （三）脉冲场凝胶电泳 （一）DNA的琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶 天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。 琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。 琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 SYBR: 新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。 SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋 提纯和未提纯质粒DNA电泳图 （二）聚丙烯酰胺电泳 （三）脉冲场凝胶电泳 三、DNA片段的纯化 1．低熔点琼脂糖凝胶电泳法 低熔点琼脂糖在水溶液中的溶解温度 （melting point）很低，在 65 ℃以下；当温度降低到 20-30 ℃时凝结成固形物。 如果需要分离特定的 DNA 片段，可用低熔点琼脂糖凝胶进行分析，然后切割带有目标 DNA 的琼脂糖凝胶块，加入适量缓冲液，加热到 60 ℃，凝胶溶化， DNA 进入水溶液中，最后通过苯酚 / 氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的 DNA 片段。 2．透析袋电洗脱法 将含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来，放在透析袋中，置于电泳缓冲液中电泳， DNA 将从凝胶块中“跑”出来。常用于回收 5kb 以上的 DNA 片段。 3．Glass Milk （bead）结合法 琼脂糖凝胶在 3 倍体积的 3M NaI 溶液作用下于 55 ℃会溶化，从而将 DNA 释放到水溶液中；在这样的高盐浓度下，有一种硅珠 可特异性吸附 DNA 。当硅珠吸附 DNA 后，通过离心的方法很容易对硅珠进行洗涤，然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的 DNA 洗脱出来。 4．Qiagen 纯化柱 第二节 RNA的分离、检测和纯化 第四章 基因操作中大分子的分离和分析 一、控制潜在的 RNA 酶的活性 1．溶液和用具的去 RNA 酶处理 用 0.1% 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水浸泡后再灭菌，或购买无 RNA 酶污染的用具。 对于电泳用具最好使用专用的，不要用于其它分析，在使用之前用洗涤剂洗涮干净，再用 3%H 2O2 和 0.1% DEPC 处理的水浸泡，清洗干净。 2．RNA 酶抑制剂的使用 为了进一步防范 RNA 降解，一般在 RNA 样品和 RNA 反应中加入 RNA 酶抑制剂，现在应用较多的是蛋白类抑制剂，如人胎盘 RNase 抑制剂。 除此之外，还有氧铜核糖核苷复合物（完全抑制剂，且抑制体外翻译）和硅藻土（吸附 RNase 吸附剂）。 二、RNA的抽提和纯化 1．酚 - 异硫氢酸胍抽提法 TRIZOL 试剂是使用最广泛的抽提总 RNA 的专用试剂 由 Gibco 公司根据酚 - 异硫氢酸胍抽提法设计，主要由苯酚和异硫氢酸胍组成 对任何生物材料的 RNA 提取，首先研磨组织或细胞，或使之裂解；加入该试剂后，可保持 RNA 的完整，同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分；加入氯仿抽提，离心