浙江大学生物化学丙实验报告1.docVIP

实验报告 课程名称： 生物化学实验（丙） 指导老师： 方祥年 成绩：__________________ 实验名称： 蔗糖酶的提取 同组学生姓名： 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法； 2、巩固理论知识，学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 1、实验内容： 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理： ①酵母细胞破碎 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 ②蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能得到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉 10g/组(3～4人） 2、实验试剂 石英砂，95%乙醇(-20℃），20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平（称量干酵母粉 ）；研砵（每组一套）；50ml高速离心管（4支/组、4孔50ml离心管架一个/组）；托盘天平（离心管平衡用）；高速冷冻离心机；恒温水浴箱（50℃）；量筒（50ml）、微量移液枪（1000ul)及枪头或移液管（1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架 ；制冰机；－20℃冰箱。 操作方法和实验步骤 酵母细胞破粹（干磨法） ①称量：称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨)：至尽可能成细粉末状（约15min） ③加液+研磨：量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液，分2次加研磨10min， 使呈糊状液体； ④离心：将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后(托盘天平上)，离心10min （条件：4℃、12000r/min） ⑤收集+测量：收集上清液并量出体积V1（样品I），另留1ml上清液（样品I ）放置－20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS分析 2、热处理 ①水浴热处理：将上步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴，保温30min， 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却：保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心：将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中，平衡后，离心10min。 （条件：4℃，12000r/min） ④收集+测量：收集上清液并量出体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存（用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS分析。 3、有机溶剂（乙醇）沉淀 ①冰浴：将热处理后的上清液加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀， 放置约20min； ②离心：转移至两支50 ml离心管中，平衡后，离心10min； （条件：4℃，12000r/min） ③收集保存：弃去上清液，用7 mL的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液溶解沉淀 留出1mL溶液，并将余下溶液转移入7 mL塑料离心管， －20℃冰箱保存。 （用于实验2离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶） 六、实验数据记录和处理 1、实验数据记录 石英砂：5.00g； 干酵母粉：10.00g； Tris-HCl提取离心后上清液体积（样品Ⅰ）V1：31.5mL； 样品Ⅰ热处理离心后上层清液体积（样品Ⅱ）V2：27.0mL。 2、实验现象： 研磨过程：干酵母颜色变浅，散发出一股难闻的气味； 第一次离心后：上清液澄清颜色土黄色；下部沉淀分层，上层酵母细胞碎片等呈棕褐色， 下层石英砂呈白色； 第二次离心后：上清液更加澄清橙黄色；沉淀为米白色，较第一次变浅； 第三次离心前：上清液柠