水中大腸桿菌m-TEC培養基檢驗方法－濾膜法(NIEAE234.50C).docVIP

水中大腸桿菌mTEC培養基檢驗方法－濾膜法 NIEA E234.51C 方法概要 本方法係以0.45 μm孔之(Escherichia coli)。水樣過濾後置於mTEC培養基(modified membrane-Thermotolerant Escherichia coli Agar，縮寫為modified mTEC Agar)44.5±0.5℃培養22~24小時，大腸桿菌會形成紅色或紫紅色方法原理培養基內含之色原(β-D-尿甘酸，5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)被大腸桿菌之尿甘酸化酶(β-D-glucuronid)催化產生紅色或紫紅色菌落。污水海水樣中大腸桿菌之檢驗干擾 水樣中含有抑制或促進大腸桿菌生長之物質時，會影響水樣之檢測結果。 檢驗使用的玻璃器皿及設備含有抑制或促進大腸桿菌生長之物質時，會影響水樣之檢測結果。 懸浮微粒過高或含有膠體的水樣易造成濾膜孔隙阻塞，或造成細菌菌落瀰漫而一般mL之量筒。 吸管：一般mL之滅菌玻璃吸管或無菌塑膠吸管，應有0.1 mL之刻度。 稀釋瓶： 100~1000 mL能耐高壓滅菌之有蓋硼矽玻璃製品。 三角錐瓶：250~2000 mL能耐高壓滅菌之硼矽玻璃製品。 採樣容器：無菌之玻璃或塑膠製有蓋容器，使用市售無菌袋亦可。 培養皿：硼矽玻璃或可拋棄式塑膠製培養皿。可使用60×15 mm、50×12 mm或其他適當大小者。 過濾裝置：能耐高溫高壓滅菌之玻璃、塑膠、陶瓷或不鏽鋼等材質構成之無縫隙漏斗，以鎖定裝置、磁力kPa者。 濾膜：使用直徑47 mm、孔徑0.45 μm且有格子記號的無菌濾膜，能使水中大腸桿菌完全滯留者。 鑷子：前端圓滑內側無波紋。 水浴槽：溫度能維持在50℃左右者。如用於44.5℃培養，溫度必須能維持在44.5±0.5℃。 培養箱：溫度能維持在35±1℃者。如用於44.5℃培養，溫度必須能維持在44.5±0.5℃。 加熱板：附磁石攪拌功能者。 天平：能精稱至0.01 g者。 高壓滅菌釜：能以中心溫度121℃（壓力約15 lb/in2或1.1 kg/cm2）滅菌15分鐘以上者。 烘箱:用於玻璃器皿等用具之乾熱滅菌，溫度能維持在160℃達2小時或170℃達1小時以上者。 試劑及材料 本方法所使用的化學葯品均為試葯級，培養基為微生物級製品。 培養基 mTEC培養基(modified mTEC Agar）成份： 3號蛋白腖(Protease Peptone ＃3) 5.0 g 酵母抽出物(Yeast Extract) 3.0 g 乳糖(Lactose) 10.0 g 氯化鈉(Sodium Chloride) 7.5 g 磷酸氫二鉀(Dipotassium Phosphate) 3.3 g 磷酸二氫鉀(Monopotassium Phosphate) 1.0 g 硫酸月桂酸鈉(Sodium Lauryl Sulfate) 0.2 g 去氧膽酸鈉(Sodium Desoxycholate) 0.1 g 5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸(5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide) 0.5 g 瓊脂(Agar) 15.0 g 使用市售商品化培養基45.6 g，加入1公升的蒸餾水，煮沸溶解後以121℃高溫高壓滅菌15分鐘，培養基最終pH值應為7.3±0.2。取出後置於45~50℃之水浴槽待溫度下降至恒溫，培養基混搖均勻後分裝於培養皿中，厚度約3~5 mm。凝固後避光保存於冰箱中備用，分裝後之培養基保存期限為14天。可依檢測需要量按比例適量配製。 無菌稀釋液 無菌稀釋液一：非海水水樣檢測稀釋用。配製方法如下： 磷酸二氫鉀儲備溶液 取3.4 g磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶於50 mL的蒸餾水中，俟完全溶解後，以1.0 M NaOH溶液調整其pH值為7.20±0.05，然後加蒸餾水至全量為100 mL，滅菌(過濾滅菌或121℃高溫高壓滅菌15分鐘)後，儲存於冰箱中作為儲存液備用。 氯化鎂儲備溶液 取8.1 g氯化鎂（MgCl2?6H2O）先溶於少量蒸餾水，俟完全溶解後，再加蒸餾水至全量為100 mL，滅菌(過濾滅菌或121℃高溫高壓滅菌15分鐘)後，保存於冰箱中作為儲存液備用。 無菌稀釋液 分別取10 mL氯化鎂儲備溶液和2.5 mL磷酸二氫鉀溶液，加入蒸餾水至全量為2000 mL，混搖均勻後，分裝於稀釋瓶中，經121℃高溫高壓滅菌15分鐘，作為無菌稀釋液備用。 無菌稀釋液二：海水或含鹽水樣稀釋用。 磷酸二氫鈉(NaH2PO4) 0.58 g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 2.50 g 氯化鈉(NaCl) 8.50 g 將上述成分溶解於1公升的蒸餾水中，混搖均勻後，分裝於稀釋瓶中