血清GPT活力的测定课件.pptVIP

血清丙氨酸氨基转移  酶（ALT）活力的测定（改良赖氏法） 同组人：陈孝炜，张极平，赖海洋 ALT酶活力单位的定义： 1ml血清（反应溶液总量为3ml）在340nm波长下，用内径为1.0cm的比色皿，在25℃，1min内生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶催化下，使NADH和氢离子变成尼克酰胺嘌呤二核苷酸，辅酶Ⅰ，吸光度下降0.001为1个转氨酶活力单位。 丙氨酸+α-酮戊二酸 → 谷氨酸+丙酮酸 丙酮酸+NADH → 乳酸+尼克酰胺嘌呤二核苷酸，辅酶Ⅰ 实验目的 1 了解血清丙氨酸氨基转移酶活力单位的定义 2 掌握血清丙氨酸氨基转移酶活力测定的方法（改良赖氏法）和临床意义。 实验原理 在实验条件下，以丙氨酸和α-酮戊二酸作为底物，经转氨酶的作用，生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的生成量，即可计算酶活力的大小。 生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯腙，后者在碱性环境中呈现红棕色，颜色的深浅与丙酮酸含量成正比。与标准丙酮酸的显色进行比较，即可测定丙酮酸的含量。 两个反应式为： 丙氨酸+α-酮戊二酸 → 谷氨酸+丙酮酸 丙酮酸+2，4-二硝基苯肼 → H2O+丙酮酸-2，4-二硝基苯腙 Α-酮戊二酸也能与2，4硝基苯肼结合生成相应的苯腙，在碱性条件下显色。两种苯腙的吸收光谱有差异，在520nm 比色时，丙酮酸-2，4-二硝基苯腙的吸光度值远较α-酮戊二酸苯腙的高。反应30分钟后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸量增加，在一定范围内，520nm处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸与α-酮戊二酸的物质的量之比呈线性关系。 实验操作 1标准曲线的绘制：取5支试管，按下表操作 混匀，室温放置10分钟后以蒸馏水调零，用520 nm波长比色，读取各管吸光度。各管的吸光度减去0号管的吸光度，然后以吸光度的差值为纵坐标，各管相应的转氨酶活力单位为横坐标，绘制标准曲线。为了方便，可将各管的吸光度相当于转氨酶的卡门氏单位列于其后。 2 酶活力的测定：取试管两支，注明测定管（T）及对照管（C），在测定前将底物液在37℃水浴中预温5分钟，再按下表操作。 混匀，室温放置10min后，以蒸馏水调零，在520nm波长处比色，读取吸光度，用T管的吸光度减去C管的吸光度，查标准曲线，即得到待测血清中所含ALT的酶活力。 参考值：5——25卡门氏单位 临床意义 ALT广泛存在于机体的各种组织中，但在肝细胞中含量最多。当肝脏有病变特别是急性肝炎及肝细胞坏死时，血清中ALT活力显著升高。在肝癌，肝硬变以及胆道疾病时，此酶活力也可中度或轻度增高。另外，其他脏器或组织的疾病，该酶活力也升高。 注意事项 1 不同血清标本的对照管吸光度基本相同，因此同一批标本只做2——3个血清对照管，求其平均值即可，也可用空白管代替对照管。但对严重脂血症，溶血的血清或超过正常值的血清进行复查时，每份标本均应做血清对照管。 2 赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好。超过此活力的标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 3 ALT底物液与2，4 –二硝基苯肼液的配制要准确，每次测定时空白管的吸光度值上,下波动不应超过0.015。如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的问题。 4 初了丙酮酸与2，4-二硝基苯肼在碱性溶液中能产成腙外，α-酮戊二酸也能与2，4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm波长处有较大差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。 * * ← ALT 乳酸脱氢酶 ← ALT 氢氧根 实验试剂 1：ALT底物液，即2mmol ? L α-酮戊二酸，20mmol/L丙氨酸。 2:pH=7.4的磷酸缓冲液（PBS） 3：丙酮酸标准液（2 mmol/L） 4:2,4-二硝基苯肼溶液（1mmol/L） 5:0.4mol/LNaOH 150 97 57 28 0 相当于ALT活力 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 0.4mol/LNaOH/Ml 混匀，置37℃水浴20分钟 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 2,4-二硝基苯肼液/mL 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH=7.4)/mL 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 ALT底物试剂/mL 0,20 0.15 0.10 0.05 0.00 丙酮酸标准液/mL 4 3 2 1 0 编号 5.00 5.00 0.4mol/L NaOH/Ml 10 —— 血清/μL