全基因组外显子测序技术在遗传性纤维蛋白原异常家系致病基因的克隆鉴定中的应用.docVIP

全基因组外显子测序技术在遗传性纤维蛋白原异常家系致病基因的克隆鉴定中的应用 　　[摘要]目的研究采用全基因组外显子测序技术在遗传性纤维蛋白原异常家系致病基因鉴定中的应用价值。方法采集12例遗传性纤维蛋白原异常患者及其核心家庭成员外周血检测凝血指标，并提取其基因组DNA进行全基因组外显子测序，分析测序结果，探讨遗传性纤维蛋白原异常的分子机制。结果全基因组外显子测序结果显示：先证者A1、A4以及B2均为FGA基因g，1233GA突变，A1的妹妹、A4的父亲以及B2的母亲均携带有相同的突变；A2、A7、B4和B5均为FGG基因g，10819GA突变，家系成员中A2的母亲和外婆、A7的姐姐和女儿、B4的母亲和B5的母亲均携带有相同的突变；A3、A5、A6、B1和B3及其相关亲属共10例携带有FGB基因g，9692AG突变。先证者及家系主要成员中发生Fg基因突变的成员APTT、PT和TT均明显延长，但Fg活性显著降低。结论遗传性纤维蛋白原异常可由多种Fg基因外显子突变导致，FGB和FGG外显子突变较为常见。 　　[关键词]遗传性纤维蛋白原异常；全基因组外显子测序；家系致病基因；基因突变 　　[中图分类号]R554.5 　　[文献标识码]A 　　[文章编号]2095-0616（2016）03-33-04 　　纤维蛋白原（Fgrinogen，Fg）能够在凝血酶作用下修饰成为纤维蛋白，在止血过程中发挥重要的生理作用，同时又可激活纤溶系统防止血栓的形成，Fg在集体出血与止血平衡中发挥重要的作用。遗传性异常纤维蛋白原血症（inheriteddvsfgrinogenemia）是人群中罕见的一种常染色体杂合显性遗传病，纯合显性遗传者少见，该病发病率低，患者多数仅表现为轻微隐匿性症状。Fg基因较为复杂，从分子发病机制上方能很好地研究和诊断遗传性异常纤维蛋白原血症。本研究于2015年1～8月针对我院收集的遗传性纤维蛋白原异常患者及其具有直接血缘关系的亲属和正常健康者，进行表型和基因分析，旨在从功能上探讨遗传性纤维蛋白原异常的分子发病机制。 　　1.资料与方法 　　1.1一般资料 　　选取遗传性纤维蛋白原异常患者及其具有直接血缘关系的亲属和正常健康者参与本研究。其中，已确诊的该疾病2个家系先证者共计12例，A家系7例，B家系5例先证者家系中的核心家系内成员共26例，A家系15例，B家系11例；正常健康者200例。12例先证者中有5例因消瘦原因就诊，生化检查表现为凝血酶原时间（PT）及凝血酶时间（TT）延长，活化部分凝血时间（Am）正常，纤维蛋白原（Fg）活性明显降低；3例先证者无临床症状，但易发生瘀斑、伤口愈合延迟，有自发流产史；4例先证者表现为经期经血过多，凝血较差，术前检查为TT显著延长，Fg活性下降。所有先证者平常均无自发出血、血栓病史，心脑、肝、肾功能均正常，所在家系中无近亲结婚史，所有成员亦无自发出血、血栓病史，心脑、肝、肾功能均正常。 　　所有患者在采集血液等样本和个人信息时均知情同意并签字，本研究经我院伦理委员会同意批准进行。 　　1.2研究方法 　　1.2.1样本收集及处理在知情同意的情况下，采集患者、家系成员静脉血，以0.109mol/L枸橼酸钠1：9抗凝，4℃下1500rpm离心15min，将血浆-进行分装于洁净冻存管中进行标记，冷冻于70℃超低温冰箱保存。提取所有研究对外周血细胞中基因组DNA进行外显子测序，-80%保存备用。 　　1.2.2家系基因分析通过QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取从采集的血浆样本中提取研究对象的基因组DNA作为下步基因扩增的模板。家系基因分析采用测序方法找寻突变位点，测序方法为全基因组外显子测序。 　　根据美国国家生物技术信息中心（NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI）基因库中公布的Fg基因序列（FGB ID：2244；FGA ID：2243；FGG ID：2266），利用Primer Premier 5.0软件设计23对引物以覆盖Fg基因的24个外显子区域及其启动子序列，其中FGA引物5对，FGB引物8对，GGG引物10对。将提取得到的DNA随机打断，将片段化的DNA分子在酶的作用下补齐随机打断造成的黏性末端而成为平末端，连接接头，通过NimbleGen外显子序列捕获芯片捕获目标外显子区域，检测其捕获效率；然后对捕获的目标片段进行PCR扩增，产物连接后随机打断，末端补平及加“A”碱基，连接测序接头，PCR扩增并检测序文库的质量，最后利用illumina公司NextSeq 500测序仪进行测序。 　　PCR扩增反应体系为：上下游引物各1.5uL、模板DNA 2uL、dN