掌叶蜂斗菜中蜂斗菜内酯―D的抗炎和抗过敏作用研究.docVIP

掌叶蜂斗菜中蜂斗菜内酯―D的抗炎和抗过敏作用研究 　　摘 要：本文旨在研究掌叶蜂斗菜提物取物对过敏反应及炎症的影响， 为其临床治疗过敏性哮喘提供药理学依据。主要通过硅胶柱色谱技术从掌叶蜂斗菜叶片中得到蜂斗菜内酯-D；采用抗原诱导的RBL-2H3 细胞活化脱颗粒模型，测定蜂斗菜内酯-D对β-HEX的影响；通过 OVA 诱导和激发 BALB/c 小鼠，构建哮喘小鼠模型，并对支气管灌洗液（BALF）中炎症细胞计数和分类计数，观察蜂斗菜内酯-D的抗过敏、抗炎作用。结果表明0.1-10ug/ml蜂斗菜内酯-D对β-HEX抑制率分别为 26.82%、34.1%、44.25%、61.32%，可见蜂斗菜内酯-D在此剂量内能够较明显抑制抗原诱导RBL-2H3细胞活化脱颗粒的β-HEX释放，抑制率与浓度相关；通过分析BALF中炎症细胞的数量， 蜂斗菜内酯-D治疗组与模型对照组相比，能有效抑制BALF中炎症细胞的数量（P0.01）。 蜂斗菜内酯-D具有良好的抗炎、抗过敏作用，可以用来治疗过敏性哮喘疾病。 　　关键词：蜂斗菜内酯-D； 抗炎； 抗过敏 　　中图分类号：Q949.783.5 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20150932001 　　掌叶蜂斗菜（Petasites tatewakianus Kitam.）是菊科蜂斗菜属植物，国内资源比较丰富。主要分布于小兴安岭、长白山地区。蜂斗菜属植物已经被证实具有很好的抗炎、抗过敏作用[1-3]。其中 蜂斗菜（Petasites japonicus （Sieb. et Zucc.）Maxim）地上部分提取物已被证实具有抗过敏和抑制肥大细胞脱粒作用[4]。同属植物欧蜂斗菜（Petasites hybridus），在欧洲应用历史悠久，其根茎中的内酯类提取物已用于治疗哮喘[5-6]。蜂斗菜属主要有效成分是倍半萜类化合物，研究表明，蜂斗菜素和硫蜂斗菜素等倍半萜类化合物具有抗组胺，阻止白三烯合成，使细胞内钙离子浓度降低的作用，从而达到对炎症和痉挛的治疗作用。本研究力图鉴定掌叶蜂斗菜叶片中的主要活性成分，并检测其抗炎、抗过敏作用，为掌叶蜂斗菜临床应用提供一定依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 植物材料 　　掌叶蜂斗菜采自吉林省白山市浑江区大镜沟乡经鉴定为蜂斗菜属植物掌叶蜂斗菜（Petasites tatewakianus Kitam.） 　　1.1.2 试剂及药物 　　200-300目硅胶，青岛海洋化工。乙醇、正己烷、乙酸乙酯，国药生产；Gibco RPMI 1640 培养基（美国 Invitrogen 公司，）；胎牛血清（上海玉博生物科技有限公司）； 抗-DNP IgE 单抗、4-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（Amresco公司）；二硝基苯基化牛血清白蛋白（美国 Biosearch Technologies 公司）；富马酸酮替芬（美国 Sigma 公司）；OVA（鸡卵球蛋白V级）购于sigma公司（美国）；其它如无特别说明为国产分析纯。 　　1.1.3 实验动物及细胞 　　实验动物SPF级4-6周龄BALB/c雌性小鼠，中国医学科学院实验动物研究所，合格证号：SCXK（京）2013-0078，RBL- 2H3细胞（美国ATCC）。 　　1.1.4 仪器 　　RE52-98型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；激光共聚焦显微镜（L8681074， NiKon，日本）；倒置显微镜（ZKD一3，OLYMPUS，日本）；台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司；CO2 培养箱（上海西域机电系统有限公司，型号：KB53）；超净工作台（上海西域机电系统有限公司，型号：SW-CJ-1D）。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 蜂斗菜内酯-D的分离 　　掌叶蜂斗菜新鲜叶片（3000g）搅拌粉碎，75%乙醇室温提取。旋转蒸发回收乙醇，剩余水溶部分分别用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取。正己烷层真空干燥得提取物（100.5g），硅胶柱色谱，以正己烷-乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱监测，洗脱液合并，将第3份硅胶柱色谱分离，以正己烷-乙酸乙酯5：1洗脱，薄层色谱监测，合并洗脱液，经重结晶得化合物。 　　1.2.2 细胞培养 　　RBL-2H3贴壁细胞用做实验细胞，RPMI-1640 培养液（含 10% 胎牛血清，100?g / mL 青霉素，100 ?g/mL 链霉素），培养温度37℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的细胞，台盼蓝排斥染色，活细胞率95%。 　　1.2.3 蜂斗菜内酯-D对抗原诱导的RBL-2H3 细胞活化脱颗粒 β-HEX 释放的影响 　　实验分组：正常组、模型组、给药组、药物阴性对照组、富马酸酮替芬阳性对