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生化BTT宣讲人：董磊目录1.吸光光度法的基本原理2定标校准及质控 吸光光度法的基本原理吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。特点灵敏度高： 准确度能够满足微量组分的测定要求： 简便快速 应用广泛光的基本性质 电磁波的波粒二象性波动性 光的传播速度:－真空中光速 2108m/s ~3.0 ×108m/sλ－波长，单位：m,cm,mm,?m,nm,? 1?m=10-6m, 1nm=10-9m, 1?=10-10mν－频率，单位：赫芝（周）Hz 次/秒 n－折射率，真空中为1h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J·s ?－频率 E－光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特) 微粒性光量子，具有能量光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外 远红外（真空紫外）50 ?m ~300 ?m200nm ~380nm10nm~200nm380nm ~ 780nm780 nm~ 2.5 ?m2.5 ?m ~ 50 ?m3. 溶液中溶质分子对光的吸收与吸收光谱?/nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律溶液颜色的深浅与浓度之间的关系可以用吸收定律来描述。它是由朗伯定律和比尔定律相结合而成的，所以叫朗伯-比尔定律。原子吸收分光光度计也符合这个定律。溶液对光的吸收 当一束强度为I的平行单色光照到溶液时，一部分光被溶液吸收，一部分光被界面散射，其余的光则透过溶液朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律吸光度越大，表示该物质对光的吸收越强。透光度和吸光度都是用来表示入射光被吸收的程度，它们之间可据式相互换算。 实验证明，单色光经过有色溶液时，透过溶液的光强度不仅与溶液的浓度有关，而且还与溶液的厚度以及溶液本身对光的吸收性能有关。其规律可用下式表示为 A＝εLc式中：A（E）——吸光度（或叫做光密度，也可用D表示）； ε——某溶液的消光（吸收）系数； C——溶液的浓度； L——光程，即溶液的厚度。II-dII0sItdxL介质厚度(cm)吸光度 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律朗伯定律(1760) A=lg(I0/It)=k1L比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2cA=εLcT－透光率（透射比）（Transmittance）A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT = εLcATA=εLcc吸光度A、透射比T与浓度c的关系吸光度吸光度吸光度0.440.220.00光源光源检测器检测器bbb光源样品样品样品检测器吸光度与光程的关系 A = ?bc 吸光度光源0.00检测器 吸光度光源0.22检测器b 吸光度b光源0.44检测器吸光度与浓度的关系 A = ?bcA0.80.60.40.20* 0 1 2 3 4mg/ml朗伯-比尔定律的分析应用溶液浓度的测定A＝ ?Lc工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光 应选用?max处或肩峰处测定2. 吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件(酸度、浓度、介质等)3. 稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强分光光度计的原理 分光光度计原理：分光光度计是目前化验室中使用比较广泛的一种分析仪器，其测定原理是利用物质对光的选择性吸收特性，以较纯的单色光作为入射光，测定物质对光的吸收，从而确定溶液中物质的含量。其特点是灵敏度高；准确度高；测量范围广；在一定条件下，可同时测定水样中两种或两种以上的物质组分含量等。 光源单色器吸收池检测系统稳压电源分光光度法的基本部件3. 吸光光度法和分光光度计通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调, 故选择性好, 准确度高.800 600 500400红λ1白光紫λ2棱镜聚焦透镜出射狭缝准直透镜入射狭缝单色器棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同平面透射光栅透镜光屏M1M2出射狭缝光栅衍射示意图光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm )。原理：利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光.定标~校准与质控1、定标：用定值物做一个反应曲线，用于未知物相同浓度的测定。2、校准：一般指涉及定量（如吸管等）用品的校正，看它的100ml是否是100ml。3、质控：日常检测工作必做的，看定标好不好，结果可靠与否的。其实用通俗一点的话来讲,定标就是用不同浓度的定标液作出一条路, 而测定的标本如同开在路上的车辆,只要不