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复旦大学 博士学位论文 metK对那西肽生物合成的影响和链霉菌高效转座系统的构建 姓名：张欣城 申请学位级别：博士 专业：药物化学 指导教师：周珮；丁晓明  复旦大学博士论文 世界上三分之二的抗生素由链霉菌产生，因而链霉菌在大规模工业生产和化学合 成酶方面有特殊作用。链霉菌基因工程的研究近年来是一个活跃的领域。本论文研究 着眼于那西肽，这是一种含有多个噻唑环并富含硫元素的非核糖体肽类抗生素，由活 跃链霉菌??????．????产生。本研究在链霉菌育种方法的基础上，主要利用 基因工程和培养基组分优化的方法来研究那西肽生物合成的代谢途径以进一步提高 那西肽的产量，适于工业生产的需要。 ?甋?，并用高效液相???证明了??佘占琢虬彼???在该株菌中的含量 比出发菌株???岣吡?倍，达到????痳?。 进行了优化，有针对性的提高培养基中的碳源和氮源，采用?ヂ笱刻牵?％葡萄糖， ?サ矸郏?％黄豆粉，???チ蛩犸В?．?チ蛩崮疲?．?％?????．?％????．?％ 和??∈笔辈辜?％黄豆粉，???ニ堪彼幔?．?％麦芽糖，???テ咸烟牵琌．?％硫 根据实验结果和文献报道的??孀A蛲揪叮?狙芯客撇庠赟．????中存在另一条 由??鞯嫉哪孀A蚝铣赡俏麟牡耐揪丁＜从捎赟．腺苷甲硫氨酸合成酶???的 高表达导致??罅坎??琒?激活了该合成途径，并在其中起到硫提供者的角色， 在通过了一系列代谢后使得菌体内半胱氨酸含量提高。而半胱氨酸是那西肽生物合成 的重要前体，所以进而使得那西肽的产量提高。 中图分类号：?  因组时代，大量新基因和功能未知基因的功能有待鉴定。对这类基因的研究将会为阐 明初生代谢和次生代谢的基因调控等生物学问题以及次生代谢药物的合成机制提供 更多的实验证据。因此大规模突变体库的构建是功能基因组研究的一个重要内容，而 利用转座子进行插入突变构建突变体库则是目前广泛应用的方法之一。 转座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在链霉菌中应用的大多数转座子 却普遍存在转座效率低下或操作繁琐等缺点。本研究利用天然存在于诺卡氏菌 ????????????????械淖W?覫??，成功构建了一个链霉菌中的微型 ??，可通过简单的接合转移将其从大肠杆菌导入到链霉菌中。实验证明该转座系统 克服了链霉菌中现有转座子系统的一些缺陷，操作简便且具有高效、随机、遗传稳定 转座突变株的大量测序和????杂交实验证实该转座系统随机性非常好，而且具有 良好的遗传稳定性。这些特点使得该转座系统在链霉菌中具有良好的应用前景。 另外在?????∩匣构菇?艘桓瞿芎土疵咕?删?褰鞢?发生同源重组的质 粒??，探索了噬菌体转座载体的构建。  ???甆????????琣???????????????????? ?? ??????瓸??? ????????． ????????? ? ??? ? ????????????????? ?????．?％???，?? ????．?％??，???％????．???????? ?????????? ?? ??％????．?／?． ? ???，?????? ???????  复旦人学博士堡窒．——．——————————————————————一 ?? ??—???? ????????瓼???? ? ????? ? ?????? ?????．????? ?? ? ????? ? ??? ????????．????琧???????? ??????????? ?????，? ????? ????? ??????? ??????????? ??? ???????瑃???? ?????? ? ??? ?? ???????????瑂???? ? ?????．? ?? ? ?? ?????? ?? ???甊??????????? ???? ? ? ? ??? ????? ?? ????? ??? ??—???????????? ?????琤? ? ?? ????? ??? ????? ? ????? ? ??????? ? ?? ?? ? ???篒??；??????；?????；怔?  ????产生，是一种新型的非吸收性动物饲料添加剂，适合于抑制肠道内革兰氏阳 性细菌的生长。肠道给药时，它具有用量低、抑菌范围广、动物体内不残留等特点， 可明显促进鸡、猪、鱼等动物的生长。 ?年代中后期，?甌???取??7⒊隼?肂??? 制剂的新方法，利用该方法他们成功的分离出了?????蚉???????，在筛 选过程中发现?????? ??．??姆⒔鸵憾訠???????的生长有 ???????。?????? 到的，后来法国科学家从阿根廷土壤中分离出来一株放线菌，经培养后由发酵液中分 离得到的那西肽，经鉴定与多硫霉素