3基因工程载体分析.ppt

生命科学学院 三、RNAi载体 商品化载体的siRNA策略示意图 生命科学学院 小结 几种基因载体的比较 质粒* 受体细胞 结构 插入片断 举例 E.coli 环状 ＜ 8kb pUC18/19 , T-载体pGEM- 3z等 λ噬菌体 E.coli 线状 9 - 24kb EMBL系列， Λ gt系列 丝状噬菌体及噬菌粒 E.coli 环状 ＜ 10 kb M13mp系列 粘粒载体 E.coli 环状 35- 45kb pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome) E.coli 环状 ≈300 kb Pel oBAC系列 PAC (P1-derived Artificial chromosome) E.coli 环状 100 - 2000 kb PCYPAC1 YAC (Yeast Artificial chromosome ) 酵母细胞 线性染色体 100 - 2000 kb MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 哺乳类细胞 线性染色体 ＞ 1000 kb 病毒载体 动物细胞 环状 SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 穿梭载体 动物细胞 和细菌 环状 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 生命科学学院 本章重点掌握的内容 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。 克隆载体DNA分子具备的条件。 标记基因的分类及其作用。 pUC18/19质粒载体的组成、优点及质粒克隆载体用途。 λ-DNA载体的构建、类型及其优点。 植物表达载体的组成、启动子的类型等 生命科学学院 OVer!!!! * 复制子（replicon）：是DNA复制时从一个DNA复制起点开始最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。像E.coli phase及质粒DNA独立复制的单位均为复制子。 质粒拷贝数,是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。 * 不相容的质粒一般都利用同一复制系统（含有相似的复制子结构），从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。 质粒不亲和性的分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 　　大多数质粒都会产生出一种控制质粒复制的阻遏蛋白质，其浓度是与质粒的拷贝数成正比的。阻遏蛋白质通过同其靶序列间的相互作用，使双链DNA中的一条链断裂，从而导致质粒DNA复制的启动，并建立起一种调节质粒拷贝数的负反馈环（negative feedback loop）。当质粒面临高拷贝数和高浓度的阻遏蛋白质时，其复制法动便被抑制了；而当质粒处于低拷贝和低浓度遏蛋白质的条条件下，它的复制反应便会继续进行。 　　由于每一种质粒的复制速率拷贝数控制，都是由一对不相容质粒产生的阻遏蛋白质总浓度联合调控的，这种交叉抑制的结果，使细胞中质粒拷贝数，比其单独感染状态下的正常拷贝数减少许多。 同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性。当一种新的质粒进入已经含有质粒的细胞中时，若两种质粒同源或近缘，它们就会竞争资源，而竞争的结果就是一个胜利另一个则被消除。但此过程需要几代或几十代或更长的细菌繁殖周期，而并不是一个快速的过程。质粒被分为两大组，同组中的质粒会相互竞争排斥。不相容现象的机制尚未详细阐明，可能是在质粒DNA复制的某个阶段起相互排斥的作用。这种现象是质粒分类的主要指标。 * 1.四环素抗性基因（Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2.氨苄青霉素抗性基因（Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。 3. 氯霉素抗性基因（Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4. 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类