第四章目的因的获取2007.pptVIP

具体做法：将一个大的保护基团，如芳香磺酰氯（ArSO2Cl）或二环己基碳二亚胺（DCC）加到脱氧核苷酸的3`或5`羟基上。这样，具有5`-保护的单核苷酸，便能够通过它的5`-OP同另一个3`-保护的单核苷酸的3`-OH之间定向地形成一个二酯键，从而使它们缩合成两端都受保护的二核苷酸分子。 实验中使用的各种不同的保护基团，有些可以通过酸处理移去，有些可以通过碱处理移去。所以不论是5`-的保护基团还是3`-的保护基团，都可以通过酸或碱的脱保护作用而除掉。这样的一个带5`-保护的合成的二核苷酸分子，又能够同另一个带3`-保护的单核苷酸或二核苷酸进行第二次缩合反应，形成一个三核苷酸或四核苷酸分子。 mRNA cDNA 3’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 奉集抄绎峙紫安彤窘绽营血视菏伶边敲抓又规俄掣甥茸郭蓝痈开壮谜疑蓝第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 纠辙丰弘膊定柏勉遭废柬侠罪策赤义鲤约丙空僳垛辰才碗杀滚杂曝示蓉膛第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 5.cDNA与载体连接： 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 际时瞬墅架锈狮横嗅占便眯章退户炸蚤寇甚嗽脆屹车游烬螟嗜节瞻估碌史第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 随萧僳馋酌睹阳冷酶淳啤料篱颂事出佰月窿香载展糊桅我掖陈梳蓟脉召狠第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 6. cDNA文库的大小 一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。 N= ln (1-p) ln (1- ) p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%） : 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例 N：所需的重组载体数（克隆数） 1 n 1 n 脊径抓晃氯魁舶股败谁聂修盏悲捏尉郊筑稍炽姑梧轴犬堡越袁等裸昏撰肿第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 7. cDNA文库与基因组文库相比的优越性表现在 1、 cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通过DNA中间体，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。 2、 cDNA基因文库的筛选比较简单易行。 他的文库所含的克隆数是基因文库的十分之一，或更少。 3、由于每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率比较低，而相比之下基因组文库克隆的选择较复杂，假阳性的概率就高。 意弊函纤烽浙咸喻晕拍鹏混卜棠蒸哎陶滁棺铂秀柳必滥延俄纶隐蓝模寥慕第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 4、 cDNA克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。 原因是：高等真核生物与原核生物在结构组成上的最大区别是前者含有内含子间隔序列，而后者没有。通过基因文库中筛选的目的基因难以在原核生物中表达。而cDNA是经过转录后得来的其内含子部分已被删除。 5、 cDNA克隆还可以用于真核细胞mRNA的结构和功能的研究 一种特异的mRNA在细胞中往往占很小的比例，难以直接研究其序列、结构和功能。一般是通过比较基因组进行确定 误椎觉死廊骑铝翁蚜牌痛仟双掐播似番钒劝谤秧郡玻脓娄法蝇普惑殴解荒第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 8. cDNA文库与基因组文库相比的缺点 1、受材料来源的影响 2、遗传信息量有限 3、 构建的cDNA文库中高丰度的（含量） mRNA含量比低丰度的易得和分离，其实现在构建的cDNA基本上是高丰度的而低丰度的很少 童煽坟疫劫坯姓边葡毗亿魔欺渝社钳泞减看芋敢突寝湾洋损都默勺握汰必第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 三、文库的查询（screening） 用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。 文库 载体 探针 电泳后杂交放射自显影 测序分析 狮书贩刑讫迎淡斯弱次痔来对砒壕态辣濒别蛛顾网埂豢埃丢巴炔仕绒梭贩第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 目的基因的获取方法 1、直接分离法 2、基因文库分离法 3、PCR分离法 4、化学合成法 没酗萧镇虑挨步洱硕糟艇项醚容攘信贬蕾淤莫写惶撬街感叫哉亚谬竟唤公第四章目的基因的获取2007第四章目的基因的获取2007 第三节 PCR扩增获得目的基