guan-6-外源基因在真核细胞中的表达课件.ppt

外源基因在真核细胞中的表达 人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。 在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素。 随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。 而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。 真核表达载体至少要含两类序列： ①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制繁殖得到足够使用的数量。 ②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。 第一节外源基因在毕赤酵母中的表达 酵母是目前最常用的表达系统之一。 优点：成长快，易培养，成本低，遗传操作方便，能进行翻译后加工和修饰 巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）用于基因工程表达外源蛋白的优点：发酵密度高；外源基因表达量高； 可以建立有效的分泌型表达；（分泌型表达？） 影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素 1、外源基因特性 　　外源基因在（巴氏毕赤酵母）Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。 不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。 Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录;不合适的mRNA 5’非翻译区的核苷酸序列和长度也可能会使基因的表达不尽人意。 提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。因此，可以通过调整高A+T含量区的核苷酸组成来避免提前终止的发生。而Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5’非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5’非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。 限于目前对Pp的了解程度，仍然无法预见某种外源蛋白是否能在其中获得高产。 2、表达框的染色体整合位点和方式 　　 虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。 　　 3、基因剂量 　　许多实例表明，含单拷贝表达框的宿主菌足以得到最佳产量，而在大多数情况下，随着拷贝数的增加表达产物量也会相应增加。Jeffrey等发现，重组CD40L的最高产量是在含有8个以上表达框的菌株中获得的。Clare等的实验结果也表明，重组鼠表皮生长因子(mECF)在Pp中的表达量与其基因量成正相关，而高拷贝、高表达量的宿主菌株可以通过一种快速DNA斑点杂交的筛选方式获得。不过个别情况下拷贝数增加对产量也会产生负效应，似乎表明分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制。 因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的。  高表达菌株的筛选只应以表达的蛋白量为唯一标准 Jeffrey等建立了一种双滤膜筛查方法，首先将菌落转在醋酸纤维素膜上，再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上，经过一段时间的培养，分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上。再用此蛋白的抗体检测，即可挑出最高蛋白量对应的克隆。用这种方法，每套滤膜可筛选100-1000个克隆，从而快速地从大量重组菌株中筛选出高表达克隆，并从每升发酵上清液中获得了255mg的重组cD40L。 4、分泌信号  　　 对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表达的方式。 有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如果不能利用自身信号肽，那么酿酒酵母转换酶或a配对因子(MFa1)的前导序列可以非常有效地引导体积稍小的产物出胞。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号表达外源基因获得成功的可能性大。 　　 但酵母表达基因工程产