小片段基因组文库的构建课件.pptVIP

* * * * 实验 小片段基因组文库的构建 基因文库 基因文库指某个生物的基因组 DNA 或 cDNA 片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。 根据文库所用的外源DNA的种类的不同 基因组文库 cDNA文库 载体 把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子 （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。 外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 常用的载体有5类： 3. 载体的种类 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 ?噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus） 基因组文库载体 P1噬菌体载体 cosmid黏粒载体 BAC载体（细菌人工染色体） PAC载体（P1人工染色体） YAC载体（酵母人工染色体） 各种载体的比较 转化 酵母 250-400 YAC 电转 大肠杆菌 120-300 BAC 电转 大肠杆菌 130-150 PAC 转导 大肠杆菌 70-100 P1 转导 大肠杆菌 30-45 黏粒 导入细胞方式 宿主 容量（kb） 载体 基因组DNA文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性。 N = ln (1-P ) / ln (1-f ) P是希望得到的覆盖率， f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值， N是所需的克隆数。举例来说，用BAC载体构建人类基因组文库， 人类基因组大小为3 x 109 bp, 插入片段大小为100kb， 希望覆盖率99%，那么所需要的BAC克隆数为N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x 10-6 = 138,298 文库克隆数的确定 基因组文库构建的基本流程： 基因组DNA片段的制备 载体的制备 将基因组DNA片段连接入载体 将重组载体转入宿主细胞。 1．载体DNA片段的制备 载体DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应 2． 外源DNA片段的制备 总DNA分离纯化 分离特定大小DNA片段 机械剪切法 酶法 部分酶切 完全酶切 3. 供体与载体DNA连接 要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分 子的分子比率。 4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增 利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复 制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化） 5. 基因组文库质量的评价 1）文库规模----随机挑取一些重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。 2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。 Fosmid library BAC library Experiment —— 小片段基因组文库的构建 片段的来源 根据实验要求选择片段的大小； 酶切产物直接回收（酶的使用与载体要一致） 酶切产物PCR扩增（T载体） 载体的选择 质粒载体 考虑因素 pMD-18T vector 0. 5 μl solution Ⅰ 5.0 μl insert DNA fragment 4.5 μl (AFLP预扩增产物） 连接 16℃连接8h