病毒感染的实验诊断课件.ppt

病毒感染的实验诊断 什么是病毒？ 病毒（virus）是一类体积微小、结构简单、有严格的细胞内寄生性的非细胞型微生物。 特点： 体积微小，只能在电镜下观察，能通过滤菌器 无完整的细胞结构：蛋白质衣壳＋核酸核心 只有一种类型核酸：RNA或DNA 有严格的细胞内寄生性，只能在活细胞内生长 以核酸复制的方式增殖，不能进行二分裂繁殖 抵抗力特殊：耐冷不耐热，对化学因素的抵抗力较一般比细菌强，耐甘油，对抗生素及磺胺类药物不敏感，干扰素可抑制病毒复制。 病毒感染的实验诊断方法 病原学诊断 病毒分离培养 显微镜检查 抗原检测 核酸检测 血清学诊断 抗体检测 IgM、IgG 一、标本采集、运送和处理 （一）标本采集 采集时间：尽早采集（越早越好） 标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择标本种类 无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素 血清学检查标本：双份血清 （二）标本的运送与保存 1.低温送检 4℃可保存数小时，-70℃可长期保存 -10 ～ -20℃下病毒易灭活，不可用于保存病毒标本 对冷冻标本应避免反复冻融 2.保湿送检 50%甘油盐水保存送检 病毒转运培养基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明胶或牛血清白蛋白的Hank’s液 3.无菌送检 抑制细菌生长 100U/ml青霉素＋100μg/ml链霉素 抑制真菌生长 2.5μg/ml二性霉素B 或40 μg/ml制霉菌素 二、病毒的形态学检查 2. 电镜及免疫电镜检查 直接检查标本中的病毒颗粒，快速，可确诊。但敏感性低（＞106/ml） 免疫电镜敏感性高，但只能用于已知病毒的检测） 三、病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离 组织培养 鸡胚培养 动物接种 1. 组织培养 将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。 组织培养的类型: （1）组织块培养 （2）器官培养 人胚气管－呼吸道病毒； 人胚肠－ 肠道病毒 （3）细胞培养 最常用 原代和次代细胞培养 二倍体细胞培养 传代细胞培养 动物新鲜组织（人胚肾等）→胰酶消化→营养液培养→单层细胞（原代细胞） 原代细胞→胰酶消化→转种培养（次代培养细胞） 对病毒敏感，但制备费时费力，只能传2～3代。 二倍体细胞株 原代细胞反复传代（50～70代）仍保持二倍体染色体特性。病毒分离和疫苗制备的首选细胞株。 传代细胞株 来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，能在体外无限增殖。增殖快，不易衰老，易于传代保存。常用于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。 优点 细胞来源广、敏感细胞株多 不受机体免疫因素的影响，个体差异小 病变结果易于观察 可用于病毒的分离鉴定和制备疫苗及抗原 缺点 条件要求相对较高，有细胞培养条件的实验室才能做 2. 鸡胚培养 新鲜受精卵 接种病毒 优点 鸡胚来源充足，操作简便，有多种接种途径 病毒增殖快，可收获大量病毒 鸡胚本身是无菌的，对接种的病毒不产生抗体 缺点 易感病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺炎病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养。 某些病毒在鸡胚内传代后，其毒力下降 3. 动物接种 常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。 接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径： 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 流感病毒 鼻腔滴种 用途 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清 优点 方法简单、结果易于观察 选择适当的接种途径，可出现类似人类的感染症状，有利于发病机制的研究 缺点 可自然带毒或隐性感染，干扰实验结果 有个体差异 很多病毒无敏感动物，或感染后不出现明显症状 （二）病毒的鉴定 病毒的初步鉴定 动物感染：敏感动物范围、潜伏期及发病情况 鸡胚接种：病毒对鸡胚的敏感性、特殊病灶（如痘疱等） 细胞培养：病毒在细胞培养中的表现 理化性质的测定：主要用于新病毒的鉴定 病毒的最后鉴定 血清学鉴定: 中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等。 分离的新病毒，必须进行系统的全面鉴定 病毒在细胞培养中的表现 1. 细胞代谢作用改变（培养液颜色变化） 正常细胞代谢： 培养液由红变黄 病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红 2. 细胞形态改变 3. 干扰现象（interference） 当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种病毒可抑制另一种病毒的增