从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶.docVIP

感谢那些把自己的ppt放到网上的学长学姐！！要不然这实验怎么做！！ 设计实验报告 12级七年儿科 实验名称 从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶 实验目的 掌握从肝细胞中分离提取纯化鉴定某种酶的实验方法 培养灵活选择并综合使用各种生物学实验方法的能力 培养探索精神和团队合作意识 实验原理 材料的选择 因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。 细胞破碎 细胞破碎可选用三种方法：机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法。本次使用机械破碎法。 机械破碎法：可选匀浆法。使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 加入蛋白酶抑制剂的目的是防止蛋白酶的水解作用。常用的蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸） 一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。 由于该酶的位置未知。故应用超速离心分离技术分离胞液中的酶体和微粒体，细胞核和线粒体。对三种成分分开研究，使得提取物中杂志减少。 （三）超速离心分离技术 悬浮液静止不动时，由于重力场作用，悬浮颗粒就要逐渐的沉降下来，颗粒越重，下沉越快，反之则上浮。但是颗粒在重力场中的沉降速度并不只与重量有关，还与密度，大小，形状有关。但当颗粒大小小于几微米时沉降速度很慢而扩散现象非常严重。所以必须用高速离心的方法，产生出强大的离心场，就产生了超速离心分离技术。 医保内不同结果的比重，大小，形态不同，在同一离心场中沉降速度不同。可根据这一原理将亚细胞组分分离。 （四）酶的提取 常用方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取。 本实验中因缺乏酶的更多信息，故采用盐溶液提取法。 盐溶液提取法 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象：大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低。 影响酶提取的主要因素： 1）酶在所使用溶剂中的溶解度； 2）酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度、黏度、扩散面积、扩散距离及两相间的浓度差有密切关系。 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度，有利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引起酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。 3）pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低，以免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。 4）提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提取液的总量一般为原料体积的3～5倍。 （五）酶的粗分离 常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤和膜分离法、萃取法等。因本实验中对此种酶的了解有限，但是已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用等电点沉淀法进行分离。 等电点沉淀法 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。 （六）酶的分离纯化 离子交换柱层析法分离纯化肝酶 离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子有不同的亲和力，来分离各种离子的层析技术。 不同离子化合物带电荷多少不同，与离子交换剂作用和强弱不同，当它们结合到固定相交换基团上以后，可以用提高流动相中离子强度或改变pH的办法，把它们从离子交换剂上依次洗脱下来，达到分离纯化的目的。 DEAE-纤维素为阴离子交换剂，在pH6.1条件下，带有正电荷，能够吸附带负电荷得物质，而pI为6.2的酶不与纤维素结合，因而留在溶液中，此时收集所得即为肝酶。 （七）脱盐 经过各种纯化手段提取的蛋白质溶液经常含有较高的盐离子浓度，需要将多余的盐离子去除，称为蛋白质的脱盐。脱盐的主要方法：透析法，超过