5.3PCR专题课件.ppt

PCR The PCR cycle 95℃ step to denature the duplex DNA, An annealing step of around 55℃ to allow the primers to bind, 72℃ polymerization step. Mg2+,dNTPs are required in addition to template,primers,buffer and enzyme PCR process Principle of PCR Result of PCR procedures template(DNA or RNA), primers, Taq enzyme, 10×PCR buffer, Mg++, 5mmol/L dNTPs pre-denaturation--denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30 PCR技术的应用 遗传性疾病 地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症 传染性疾病 临床检验 肝炎 （甲肝、乙肝、丙肝。。。） 性病 肿瘤 法医学 个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。 植物遗传育种 构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统进化 畜 牧 畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼 植物保护 杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分 * * PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. Peoples Choice Reaction 历史 60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主 “经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 核酸体外扩增最早设想遗忘:当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物； 当 (1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能！ Kary Mullis(1985) 发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到: “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 发展过程： 开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。 PCR发展速度 惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获 PCR reaction components and their functions template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage plaques. DNA：very stable primes If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5’-